تشخیص HLA به روش سرولوژیک

تاریخچه آزمایش تعیین سازگاری بافتی به زمانی بر می گردد که دانشمندان آنتی بادی های آگلوتینه کننده لکوسیتی را در سرم بیمارانی که در معرض آلوآنتی ژن ها از طریق انتقال خون یا بارداری قرار گرفته بودند، مشاهده کردند. محققین از این آنتی بادی ها به عنوان معرف های فنوتایپ منحصر به فرد افراد که خصوصیات متفاوتی را شناسایی می نمودند، استفاده می کردند. آنتی ژن های HLA بر اساس شباهت های ساختاری و عملکردی به کلاس یک و دو طبقه بندی شده است تا کنون سه جایگاه HLA کلاس یک با نام HLA-A, B, C و ۵ جایگاه HLA کلاس دو با نام های HLA-DR, DQ,DP,DM,DO شناسایی شده و مورد مطالعه قرار گرفته است. همچنین بیش از ۱۸۰۰ پلی مورفیسم مشخص شده است.

مولکول های HLA کلاس یک (A, B, C) در سطح اکثر سلول های هسته دار و پلاکت ها وجود دارند و مولکول های کلاس دو (DR, DP, DQ) در سطح سلول های B، سلول های عرضه کننده آنتی ژن مانند سلول‌های دندریتیک، بیگانه‌خوار و سلولهای اندوتلیال مشاهده می‌شوند و در سیستم ایمنی، برای تشخیص خودی از غیر خودی، نقش اساسی ایفا می کنند. آنتی ژن های HLA، به عنوان حامل برای حضور پپتیدها درسطح سلول استفاده می شوند. HLA با تحریک پاسخ ایمنی مناسب از طریق میان کنش HLA- گیرنده سلول T، شاخص های غیر خودی را تشخیص می دهد. جایگاه ژنی HLA انسان در موقعیت P21.3 روی بازوی کوتاه کروموزوم ۶ و در محلی به نام کمپلکس اصلی سازگاری نسجی MHC قرار دارد. ظرفیت این ناحیه ۴ مگا باز است. ژنهایHLA در هر فرد بصورت هم غالب بروز می کنند، به عبارتی هر فرد دو آلل از چندین آلل HLA بسیار پلی مورفیک به ارث برده از پدر و مادر را بر سطح سلولهای خود بروز می دهد. به این ترتیب شانس اینکه، دو شخص که برادر و خواهر نیستند HLA مشابه داشته باشند، بسیار کم است. آنتی ژن های HLA به عنوان شاخصی برای شناسایی خودی از غیر خودی در سیستم ایمنی عمل می کند و هراختلافی در HLA پیوندی به عنوان محرک برای پاسخ ایمنی عمل می نماید.

سیستم HLA به عنوان یک مارکر اپیدمیولوژیک در انگشت نگاری DNA (تعیین هویت و ابوت)، سازگار بودن پيوند دهنده و گيرنده، جهت كاهش احتمال پس‌زدنGVHD ، جهت ترانسفوزيون پلاكت سازگار در بيماران مقاوم استفاده می شود. همچنین بسياري از آنتي‌ژن‌هاي HLA با بيماري‌هاي خود ايمني نظیر اسپونديليت آنكيلوزان،آرتروپاتي‌هاي واكنشي از جمله سندرم رايتر، بيماري سلياك، گلومرولونفريت غشايي ايديوپاتيك، سندرم گودپاسچر و پمفيگوس ولگاريس ارتباط دارند.

روش های تعیین HLA

شناسایی آنتی ژنهای HLA کلاس Iد(HLA Class I)

آزمایش میکروسایتوتوکسی سیتي (Microcytotoxicity test)

اولین روش استفاده شده برای تعیین پلی مورفیسم HLA، لنفوسایتوتوکسیسیتی وابسته به کمپلمان بود که توسط Terasaki و Mc Clelland گسترش یافت. در این آزمایش كه روشي سرولوژيك مي باشد، آنتی سرمهای حاوی آنتی بادی مشخص ضد HLA با لنفوسیت های خون محیطی مجاور گردیده و بعد از گذشت زمان انکوباسیون، کمپلما ن سرم خرگوش به آن اضافه گردیده و مجددا انکوبه می گردد. در صورتی که در سطح لنفوسیت ها آنتی ژنی که آنتی بادی آن در آنتی سرم موجود است، وجود داشته باشد، کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی تشکیل می شود و سپس کمپلمان فعال می شود. در اثر فعال شدن کمپلمان در غشای سلولی منافذ کوچکی ایجاد می گردد و لیز سلولی اتفاق می افتد. این سلول های لیز شده با استفاده از رنگ حیاتی ( ائوزین، تریپان بلو) در زیر میکروسکوپ دارای فاز کنتراست قابل مشاهده و شمارش می باشند.

شناسایی آنتی ژنهای HLAکلاس IIد(HLA Class II)

در این موارد چون HLA –DR بر روی لنفوسیت های B هستند باید لنفوسیت های B و T را جدا کرد. علاوه بر این آنتی سرم های B نیز باید خالص باشند که برای این امر از پلاکت ها برای جذب آنتی سرم های HLA-A, B, C استفاده می شود. اساس آزمایش مانندHLA-A, B, C است و فقط زمان های انکوباسیون طولانی ترند. لازم به ذکر است که کارایی روش فوق الذکر (روش سرولوژیک) برای شناسایی آنتی ژن های کلاس II قابل قبول نیست و برای HLA- DR می توان از آزمایش کشت مخلوط لکوسیتی (MLC)استفاده نمود.

آزمایش کشت مخلوط لکوسیتی (Mixed Lymphocyte Culture, MLC)

در این آزمایش قرابت آنتی ژنهای کلاس II و به عبارت دقیق تر تشابه يا اختلاف آنتی ژنهاي HLA–DR, DQ, DP لنفوسیت های دو فرد مورد بررسی قرار می گیرد. در این آزمایش چنانچه لنفوسیت های دو نفر را که از نظر آنتی ژنهای کلاس II با هم متفاوتند با یکدیگر مجاور کنند، لنفوسیت های هر فرد در مقابل لنفوسیت های دیگری تحریک شده و تزاید می یابد. برای سهولت درک واکنش به طور معمول يك نمونه را تحت تأثیر اشعه یا برخی مواد، غیر فعال نموده (به عنوان محرک)، و دیگری را به عنوان واکنشگر مورد استفاده قرار می دهند؛ به این آزمایش MLR یک طرفه گویند. غالباً نوع آنتی ژن سلول محرک مشخص است و از روی آن تفاوت یا تشابه لنفوسیت های پاسخ دهنده را معین می کنند. بدین ترتیب که اگر آنتی ژنهای هر دو نوع یکسان باشند سلولهای پاسخ دهنده تحریک نمی شوند، اما اگر اختلاف داشته باشند متعاقب آن تکثیر لنفوسیت های پاسخ دهنده بوقوع می پیوند. درجه تکثیر لنفوسیت ها را می توان با توانایی این سلول ها در جذب تایمیدین رادیواکتیو در DNA مورد سنجش قرار داد. مزیت این روش نسبت به میکروسیتوتوکسیسیته در این است که میزان فعالیت سلولهای T_H را در پاسخ به آنتی ژن های MHC کلاس دو، یک بافت بهتر نشان می دهد. و از معایب آن می توان به طولانی بودن زمان انجام آزمایش اشاره کرد.

توجه:

این آزمایش باید بلافاصله بعد از انجام نمونه گیری انجام شود.
در صورتی که نمونه گیری خارج از آزمایشگاه انجام می گیرد بعد از انجام نمونه گیری، نمونه بلافاصله به آزمایشگاه ارسال گردد.
برای انجام آزمایشات سرولوژیک نمونه در دمای اتاق و برای انجام آزمایشات مولکولی، نمونه باید در یخچال نگهداری شود.

منابع برگزیده:

کتاب اصول ایمونولوژی تالیف دکتر محمد علی عصاره زادگان
DNA METHODS FOR HLA TYPING A WORKBOOK FOR BEGINNERS
Abbas A, Lichtman A: cellular and molecular Immunology, fifth edition, 2003
en.wikipedia.org

عزيزاني که ساکن اهواز هستند ميتوانند از آزمايشگاه پاستور اهواز با بهترين امکانات و تکنولوژي روز، جهت هر نوع آزمايشي استفاده نمايند.

با تشکر مديريت سايت آزمايشگاه اهواز – پاستور