کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
(High Efficiency Liquid Chromatography (HPLC ))
كروماتوگرافی روشي براي تشخیص، جدا سازی و اندازه گيری مواد می باشد. HPLC (كروماتوگرافي مايع با فشار زياد يا كروماتوگرافی مايع با کارایی بالا) یکی از پرکاربردترین روش‌های کروماتوگرافی است.
HPLC از دو فاز ثابت و متحرك تشكيل شده است. كه فاز ثابت جامد و یا مایع (مواد متراکم شده درون ستون) و فاز متحرك مايع است. این روش با استفاده از فاز متحرک ترکیبات یک مخلوط را روی فاز ثابت جدا می‌کند. در ابتدا ترکیبات در یک حلال حل می‌شوند، سپس تحت فشار بالا داخل یک ستون کروماتوگرافی جریان می‌یابند و بدین ترتیب ترکیبات مخلوط در ستون از هم جدا می‌شوند. میزان تفکیک‌پذیری به مقدار میان کنش بین ترکیبات حل شده و فاز ثابت بستگی دارد. انتخاب حلال‌ها و فازهای ثابت مختلف می تواند موجب تغییر میان‌کنش جسم حل شده با فازهای متحرک و ثابت شود. حساسیت بالا، سازگاری سریع آن برای انجام اندازه‌گیری‌های کمی، و کاربرد گسترده آن در زمینه‌های مختلف علوم و صنعت موجب شده که HPLC به عنوان یکی از روش های بسیار کارآمد رشد سریعی را در بین روش های جداسازی تجزیه ای داشته باشد.
HPLC یک فرآیند جذب سطحی پویا است. هنگامی که مولکول‌های ماده مورد آزمایش از میان دانه‌های متراکم و متخلخل ستون حرکت می‌کنند، جذب سطحی می‌شوند. در روش های HPLC انواع مختلفی از نیروهای جذب سطحی، ممکن است در فرآیند بازداری موثر باشند. مهمترین میان کنش‌ها در جداسازی فاز معکوس، میان کنش‌های آبگریز، در روش فاز نرمال، میان‌کنش‌های قطبی، و میان‌کنش‌های یونی نیز در کروماتوگرافی تبادل یونی، موجب بازداری ترکیبات می‌شوند. همه این میان‌کنش‌ها به صورت رقابتی با یکدیگر عمل می‌کنند. مولکول‌های مورد تجزیه با مولکول‌های حلال شوینده، برای جذب سطحی روی مکان‌های فعال فاز ثابت رقابت می‌کنند. بنابراین هر چه مولکول‌های مورد تجزیه، میان کنش قوی‌تری با سطح داشته باشند، میان‌کنش شوینده ضعیف‌تر بوده و ماده مورد تجزیه زمان طولانی‌تری روی سطح فاز ثابت باقی می‌ماند.
از جمله کاربردهای HPLC می توان به اسیدهای آمینه، پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک کربوهیدرات ها، داروها، حشره‌کش‌ها، آنتی‌بیوتیک ها، استروئیدها، گروهی از مواد گوناگون آلی و معدنی اشاره نمود.
ویژگی های HPLC
- استفاده از روشHPLC بسيار آسان است.
- مدت زمان لازم برای آناليز بسيار اندک است.
- در سيستمHPLC دو فاز ثابت و متحرک با مكانيسم رقابتی عمل می كنند که این امر موجب انجام آناليزهای دقيق می شود.
- در این روشبرای هر گروه از تركيبات خاص، دتكتورهای انتخابی ويژه وجود دارد كه کمیت و کیفیت آناليز را به بهترين صورت ممکن افزايش می دهند.
- تركيبات آلی ناپايدار و غیر فرار به سادگی تحت آناليز قرارمی گيرند.
- جداسازی، خالص سازی و شناسایی پروتئین ها و ترکیبات آلی بویژه ترکیبات دارویی با این روش به خوبی انجام می گردد.
- آناليز كمی با حساسيت و دقت زیادی امكان پذير است.
- تعیین ساختار پلیمرها
- مقایسه ساختار پروتئین های مختلف
- هرگونه ناخالصی با قطبيت های مختلف، قابل تشخيص است.
- وجود ناخالصی هایی با وزن ملكولی بسيار بالا قابل تشخيص است.
- وجود آب در نمونه های آزمايشي مشکلی در طی آناليز بوجود نمی آورد.
- ملكولهای آب دارای پیوند هيدروژنی قابل ارزيابی است.
- سهولت تجديد پذيری(Reproducibility) از مزیت های عمده سيستم HPLC محسوب می شود.
قسمت های مهم دستگاه HPLC
- سیستم انتقال حلال (پمپ)
- محل تزریق (Injector)
- ستون
- آشکار ساز
- کامپیوتر برای ارزیابی اطلاعات
سیستم انتقال حلال ( پمپ)
در دستگاه HPLC ستون ها نسبتا طويل و اندازه ذرات كم و به همین دلیل قابليت نفوذ كم مي شود. براي اين كه محلول جريان داشته باشد بايد فشار وجود داشته باشد که این فشار توسط پمپ ها ایجاد می شود. پمپ، محلول را از مخزن مي گيرد و با سرعت معین آن را بر روي فاز ثابت حركت می دهد. هر چه جریان فاز متحرک كمتر باشد، فاصله پيك ها بيشتر است.
حلال ها در HPLC
- حلال هایی که در HPLC استفاده می شوند شامل متانل – استونیتریل – آب مقطر – بافرها می باشند.
- در روش HPLC باید آب مقطر ۲ بار تقطیر استفاده گردد و آب مقطر قبل از استفاده با فیلتر های آبی ۴۵/۰ میکرون فیلتر شود.
- حلال ها باید از کیفیت مناسب (از نظر خلوص) برخوردار باشند. برای اطمینان بهتر است این حلال ها قبل از استفاده با فیلترهای آلی ۴۵/۰ میکرون فیلتر شوند.
- در HPLC حلال های ما باید عاری از گاز هایی مثل اکسیژن باشند؛ برای این کار از گاز هلیوم با خلوص بسیار بالا استفاده می شود.
محل تزریق (Injector)
برای تزریق از سوزن های با مقادیر مختلف استفاده می شود. مقدار حجم تزريق ۳۰ ميكروليتر است. نمونه ابتدا وارد قسمتي به نام گارد كالوم يا پري كالوم مي شود كه محافظ ستون است و با ماده ای از جنس ماده پركننده ستون پر شده است. در صورتی که ماده مورد آزمایش ناخالصي داشته باشد يا با ماده داخل ستون واکنش دهد درگاردكالوم انجام مي شود و به ستون آسيبي نمي رسد.
ستون
انتخاب نوع ستون براساس ماده مورد آزمایش تفاوت دارد ستونها با مواد مختلفی پر می شوند. فاز ثابت بصورت ذرات ريزي در داخل ستون قرار گرفته است. كه بر اثر چسبيدن و پخش شدن اجزای نمونه و عبور فاز متحرك جداسازي انجام مي شود. نمونه ابتدا وارد گاردكالوم و بعد وارد ستون مي شود. کار ستون به اندازه ذرات داخل ستون بستگی دارد. هرچه اندازه ذرات کوچک‌تر باشد، کیفیت HPLC بهتر است. برای مثال ستون C18 از سیلیکاژل اصلاح شده پر شده است.
آشکارساز(Detector)
اغلب از آشکارسازهای UV استفاده می شود.
ارزیابی اطلاعات
ارزیابی اطلاعات در روش HPLC با استفاده از کامپیوتری که برنامه نرم افزاری مربوط به دستگاه HPLC روی آن نصب شده باشد، انجام می گیرد. اغلب برای ارزیابی اطلاعات از سطح زیر پیک ها استفاده می شود نه ارتفاع پیک.
