تکی : Post

روش های تشخیص آزمایشگاهی مایکوباکتریوم ها

مایکوباکتریوم ها باسيل های هوازی اجباری یا میکروآئروفیلیک ، اسیدفست ، گرم مثبت ضعیف و میله ای شکل هستند. مایکوباکتریوم ها باکتری های داخل سلولی اجباری بوده که درون مونوسیت ها و ماکروفاژها رشد می کنند. این باکتری ها بدون اسپور ، حرکت و کپسول بوده و در بافت ها به صورت باسیل های دراز و باریک دیده می شوند، اما در محیط های کشت مصنوعی ممکن است به اشکال کوکسوئید یا فیلامانی دیده شوند.

۱) جنس مایکوباکتریوم 

خانواده مایکوباکتریاسه فقط حاوی جنس مایکوباکتریوم می‏باشد که باسیل‏های گرم مثبت هوازی با محتوای ژنومیک GC 70-62 درصد می‏باشند. افتراق بیوشیمیایی مایکوباکتریوم ‏ها از سایر جنس‌های مشابه، بوسیله آنالیز اسید چرب و یا اسید‌های مایکولیک صورت می‌گیرد. مایکوباکتریوم ‏ها در دیواره سلولی خود حاوی اسید مایکولیک از نوع شیمیوتایپ IV هستند. با این حال رنگ آمیزی ذیل نلسون از مشهورترین و در عین حال ساده ترین روش‏ها برای شناسایی اولیه مایکوباکتریوم‏ها می‌باشد. در اواخر دهه ۱۹۵۰ میلادی رانیون  مایکوباکتریوم‏ها را براساس تولید پیگمان  و سرعـت رشد به چهار گروه طبقه بندی نمود که عبارتند از: فتوکروموژن ، غیرکروموژن ، اسکوتوکروموژن  و مایکوباکتریوم‌های تند رشد. مایكوباكتريوم های تند رشد در محیط های جامد کمتر از ۷ روز کلنی قابل مشاهده تشکیل می دهند و اغلب گونه های غیرتوبرکلوزی NTM دراین گروه قرار دارند. سایر گونه های موجود در گروه های رانیون جزء دسته کند رشد ها محسوب می شوند. برای رشد این گونه ها در محیط های جامد ، بیش از ۷ روز زمان لازم است و باسیل های کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و تعدادی از گونه های غیر توبرکلوزی در این گروه قرار دارند. اعتقاد بر این است که بسیاری از گونه‌های کند رشد در ارتباط با بیماری در انسان و یا حیوانات هستند. بر خلاف گونه‌های کند رشد ، اغلب گونه‌های تند رشد کمتر برای انسان بیماری زا می‌باشند و به عنوان پاتوژن فرصت طلب در نظر گرفته می‌شوند.

۲ ) مایکو باکتریوم عامل سل (Mycobacterium tuberculosis) 

مایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل سل، عضوی از یک مجموعه است که حداقل ۹ گونه دارد:

1. tuberculosis sensu stricto، M. africanum، M. canetti، M. bovis، M. caprae،
2. microti، M. pinnipedii، M. mungi و M. orygis.

 مایکوباکتریوم توبرکلوزیس دارای رشد کند وآهسته است و در محیط های کشت به مدت ۳ تا۸  هفته باید انکوباسیون شوند . کلنی های باسیل سل در محیط جامد کوچک ، خشک ، فلسی و در مدت ۱۰تا۲۰ روزظاهر می شوند . زمان تقسیم مایکوباکتریوم ها (Generation time)14 تا ۱۵ ساعت و  در برخی منابع تا ۱۸ ساعت ذکر شده است.  به علت وجود موم و چربی در جدار باکتری ، انتقال مواد غذایی به کندی به داخل سلول صورت گرفته و به همین خاطر رشد این باکتری آهسته است.

۳) مایکوباکتریوم های غیر سلی (NTM) 

مایکوباکتریوم های غیرتوبرکلوزی گروه وسیعی از مایکوباکتریوم ها هستند و به نام های مختلف خوانده می شوند که عبارتند از : مایکوباکتریوم های آتپیک ، طبقه بندی نشده ، توبرکلوئید و محیطی.   این باکتری ها به طور گسترده ای در محیط زیست یافت می شوندو از این طریق نیز
می توانند به انسان منتقل شوند. شواهدی از انتقال مایکوباکتریوم های غیر سلی حیوان به انسان یا انسان به انسان از وجود ندارد. اغلب این گونه های بیماری زا نیستند ولی ممکن است در شرایطی پاتوژن فرصت طلب باشند. از طرفی  گونه های  NTMبا کلونیزاسیون های گذرا می توانند موجب آلودگی نمونه های بالینی شوند. به علت پراکندگی گونه های NTM در محیط ، تفسیر جداسازی آنها پیچیده می باشد. اکثر بیماری های حاصل از مایکوباکتریوم های غیرسلی توسط مجموعه مایکوباکتریوم آویوم، مایکوباکتریوم کانزاسی ، مایکوباکتریوم آبسسوس  ایجاد می شوند. شایان ذکر این است که تحقیقات اخیر حاکی از افزایش میزان  مایکوباکتریوم آبسسوس بوده و همچنین درمان عفونت این باکتری نیز بسیار دشوار است.

۱-۳)  علائم بیماری های ناشی از مایکوباکتریوم های غیرسلی 

مایکوباکتریوم های غیرسلی به سرعت در عفونت های کاتتر، عفونت های پس از لیزیک (نوعی عمل چشم)، پوست و بافت نرم (به خصوص در جراحی های زیبایی) و عفونت های ریوی در حال افزایش هستند. شايع ترين علائم بالينی بيماری مایکوباکتری های غیرسلی، بيماری ريوی است، اما موارد درگیر شدن بافت لنفاوی، بافت نرم نظیر پوست و همچنین به صورت عفونت منتشره نيز مشاهده می شود. بیماری ریه ناشی از مایکوباکتریوم های غیرسلی اغلب در زنان یائسه و بیماران مبتلا به بیماری های ریوی مانند سیستیک فیبروز، برونشکتازی و ابتلای قبلی به سل دیده می شود. بیمارهای ریوی ناشی از مایکوباکتریوم های غیرسلی همچنین در افراد مبتلا به ایدز و بیماری های بدخیم یافت می گردند که می تواند توسط بسیاری از گونه های مایکوباکتریوم های غیر سلی (به منطقه بستگی دارد) ایجاد شوند؛ البته اغلب این گونه ها مجموعه مایکوباکتریوم آویوم و مایکوباکتریوم کانزاسی می باشند. نوع و شدت علائم بالینی ناشی از مایکوباکتریوم های غیر سلی متفاوت است، اما به طور معمول این علائم شامل سرفه مزمن اغلب همراه با خلط چرکی و ممکن است خلط خونی نیز وجود داشته باشد. علائم سیستمیک در عفونت پیشرفته شامل ضعف، خستگی و کاهش وزن است.  تشخیص عفونت ریوی حاصل از مایکوباکتریوم آبسسوس نیازمند وجود علائم ، ناهنجاری های رادیولوژیک و نتایج حاصل از کشت میکروبی می باشد.

لنفادنیت در این نوع عفونت ها می تواند توسط گونه های مختلف مایکوباکتریوم های غیرسلی ایجاد گردد. اما عامل اصلی این بیماری در سراسر جهان، مجموعه مایکوباکتریوم آویوم است. اکثر بیماران مبتلا در سنین کمتر از ۵ سال هستند، اما شیوع آن در کودکانی که واکسن BCG دریافت نموده اند نادر است. بیماری بافت نرم ناشی از عفونت مایکوباکتریوم های غیرسلی شامل آبسه های پس از ضربه، گرانولومای استخر شنا (ناشی از M. marinum) و زخم Buruli (ناشی از M. ulcerans یا M. shinshuense) می باشد . آبسه های پس از ضربه اغلب بعد از تزریق اتفاق می افتد.

بیماری مایکوباکتریایی منتشر در بیماران مبتلا به ایدز در ایالات متحده و اروپا در دهه ۱۹۸۰ و اوایل دهه ۱۹۹۰ معمول بود، هرچند که شیوع آن از زمان استفاده از درمان بسیار فعال ضد رتروویروسی در کشورهای توسعه یافته، کاهش یافته است. این بیماری همچنین پس از پیوند کلیه نیز در افراد نیز ممکن است رخ دهد.

۴)  اصول و تشخیص درمان بیماری های مایکوباکتریایی

اصول جداسازی مایکوباکتریوم براساس جداسازی ارگانیسم های عامل بیماری از نمونه بیمار مانند : خلط ، ادرار ، بافت استخوان ، مایعات بدن ، خون و … می باشد که ممکن است همرا با علائم بالینی ، یافته های رادیوگرافی مشکوک ، وضعیت سیستم ایمنی فرد و تاریخچه بیماری باشد. تشخیص بیماری سل براساس علائم بالینی، نتایج آزمایشگاهی، میکروب شناسی، آسیب شناسی،  تست پوستی توبرکولین و رادیوگرافی صورت می گیرد. در مورد مایکوباکتریوم های غیر سلی فرصت طلب اثبات  اهمیت بالینی ایزوله ها به دلیل محیطی بودن آنها مهم است. لذا بر اساس معیار های انجمن ریه امریکا (American Thorasic Society) که شامل جداسازی مکرر و شناسایی پاتوژن و تطبیق آن با ویژگی های بالینی و رادیولوژیک بوده ، صورت می گیرد.

۱-۴)  شناسایی گونه های مایکوباکتریوم

برای شناسایی و تعیین هویت مایکوباکتریوم ها طیف وسیعی از ساده ترین تست های آزمایشگاهی تا پیچیده ترین متدهای مولکولی و غیرمولکولی طراحی شده  که هر کدام از این روش ها دارای نقاط قوت و ضعف زیادی می باشند. به دلیل ماهیت کند بودن رشد مایکوباکتریوم ها و همچنین نزدیکی بسیار زیاد تعدادی از گونه ها به همدیگر ، افتراق گونه های مایکوباکتریوم از همدیگر نیز دارای پیچیدگی های خاص خود می باشد.

۲-۴)  تست های رایج میکروبیولوژیک 

هنگامی که یک گونه مایکوباکتریوم  از نمونه های بالینی جداسازی می گردد، برای تشخیص قطعی باید گونه مورد شناسایی قرار گرفته و در صورت لزوم از لحاظ اپیدمیولوژیک مانند بررسی نحوه انتقال از یک بیمار به دیگری ، عفونت جدید و یا عود بیماری مورد تجزیه و تحلیل مناسبی قرار گیرد. جداسازی و شناسایی دقیق گونه های بیماری زای مایکوباکتریوم از نمونه های بالینی مختلف فرآیندی بسیار طولانی ، هزینه بر و پیچیده می باشد که علاوه بر نیاز امکانات مناسب به افراد با تجربه دراین زمینه نیازمند می باشد. بلافاصله بعد از دریافت نمونه بالینی ابتدا رنگ آمیزی های مخصوص مانند زیل نلسون و فلورسنت برای مشاهده مستقیم به کار گرفته می شوند. همچنین از نمونه ها برروی محیط کشت های مناسب نیز کشت داده می شود. بعد از جداسازی عامل بیماری زا با استفاده از تعدادی تست بیوشیمایی و در نهایت به کمک تست های مولکولی به شناسایی کامل گونه پرداخته می شود.

۳-۴)  آزمایش میکروسکوپی (مستقیم) 

در تشخیص و کنترل روند درمان بیماری های مایکوباکتریایی، آزمایش میکروسکوپی یا مستقیم بسیار حائزاهمیت است و ساده ترین روش ارزیابی نمونه های آلوده بیمار است.از نمونه گرفته شده  گسترش تهیه و سپس رنگ آمیزی انجام می شود ، انواع رنگ آمیزی ها عبارتند از :

• زیل نلسون با حرارت (اسید فست) ———–>  باسیل قرمز در زمینه آبی دیده می شود

دررنگ آمیزی اسید فست ابتدا  اسمیر تهیه کرده  سپس نمونه را با کربول فوشین قرمز نموده و جهت نفوذ رنگ آن را حرارت می دهیم. سپس اسید الکل ( اتانول ۹۵% و اسیدکلریدیک ۳% ) را روی اسمیر ریخته و رنگ بر متیلن بلو را اضافه می نماییم.  لیپید های دیواره سلولی مایکوباکتریوم با اضافه شدن اسید الکل حل نمی شوند و بنابراین رنگ قرمز به خود می گیرند، اما باکتری های غیر اسید فست رنگ قرمز را از دست داده و آبی می شوند.

√ کینیون (روش رنگ آمیزی سرد) : دراین روش رنگ کربول فوشین و فنل غلظت بیشتری دارد و نیازی به حرارت نیست. دراین روش باسیل رنگ قرمز در زمینه آبی مشاهده می شود.

√ اورامین رودامین (فلورسنت)  ———->  باسیل طلایی یا نارنجی درزمینه تاریک دیده می شود.

√تن تیام هاک ———-> باسیل اسیدفست به رنگ قرمز روی زمینه آبی دیده می شود.

√ در رنگ آمیزی گرم به صورت گرم مثبت  هستند اما به صورت کم رنگ دیده می شود.

تعداد باسیل	گزارش
صفر	باسیل اسید فست دیده نشد
۲-۱در هر اسلاید	تعدادباسیل ها گزارش و تکرار آزمایش درخواست شود
۹-۳در هر اسلاید	نادر یا +
۱۰ یا بیشتر در هر اسلاید	اندک یا++
۱یا بیشتر در میدان میکروسکوپی	زیاد یا +++

۴-۴)  کشت

استاندارد طلایی جهت تشخیص مایکوباکتریوم کشت می باشد. برای کشت مایکوباکتریوم استفاده از هر دو محیط جامد و مایع کاربرد دارد . به طور کلی سه نوع محیط کشت برای مایکوباکتریوم وجود دارد :

۱- محیط های برپایه آگار مثل محیط میدل بروک  ۷H11یا ۷H10

۲-محیط آبگوشت مثل محیط میدل بروک  ۷H9یا ۷H12 یا دوبوس توئین آلبومین

۳-محیط های برپایه تخم مرغ مانند

1. Lowenstain-jensen  – ogawaوstonebrink
2. محیط دورسه
3. محیط پتروف
4. محیط هرالد

در اغلب آزمایشگاه ها اولین انتخاب برای کشت نمونه ، محیط کشت بر پایه ی تخم مرغ است . در کشت ، به طور معمول  نمونه خلط گرفته شده از بیماران مشکوک به سل ریوی  مورد آزمایش قرار می گیرد. اما بیماری سل ممکن است در سایر نقاط بدن نیز روی دهد. در این صورت در مواردی که احتمال سل خارج از ریه ها وجود دارد انواع نمونه های بالینی مانند ادرار ، مایع مغزی  نخاعی ، چرک ، مدفدع ، بافت ، خون و مغز استخوان می تواند مورد بررسی قرار گیرند.

۵-۴) محیط های کشت جایگزین

در حالی که محیط کشت لوین اشتاین  جانسون مشهورترین محیط کشت برای مايکوباکتريوم ها می باشد، اتحاديه بين المللی مبارزه با سل، توصيه نموده  چندين محیط کشت جايگزين نیز مورد بررسی قرار گیرند.

۶-۴) محیط کشت جامد

• Egg-based – Petragnani mediumand Dorset medium
• Middlebrook 7H10 agar
• Middlebrook 7H11 agar
• Blood-based – Tarshis medium
• Serum-based – Loeffler medium
• Potato-based – Pawlowsky medium

۷-۴)  محیط کشت مایع  

• Dubos’ medium
• Middlebrook 7H9 broth
• Proskauer and Beck’s medium
• Sula’s medium
• Sauton’s medium

۸-۴) محیط کشت لوین اشتاین جانسون (Lowenstein-Jensen ) 

محیط کشت لون اشتاین جانسون شناخته شده ترین محیط کشت برای کشت گونه های مایکوباکتریوم، به ویژه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس می باشد. هنگامی که مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در این محیط رشد می کند ، کلنی هایی تقریبا قهوه ای رنگ، دانه دانه  (گاهی به نام “buff، خشن و سخت”) ایجاد می کند. این محیط کشت  به دلیل مدت زمان لازم برای تقسیم مایکوباکتریوم عامل سل (۲۰-۱۵ ساعت) به مدت ۴ هفته انکوباسیون  می شود. در این محیط میزان اندکی پنی سیلین و نالیدیکسیک اسید وجود دارد که رشد سایر باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی را مهار نموده و فقط به گونه های مایکوباکتریوم محدود می شود. وجود مالاشیت سبز (malachite green) در محیط ، رشد اکثر باکتری ها را مهار می کند. همچنین وجود گلیسرول در این محیط موجب افزایش رشد مایکوباکتریوم می گردد. در صورتی که محیط های کشت در لوله های آزمایشگاهی ساخته شوند ، باید آنها در جای خنک نگهداری شوند و در مدت یک ماه استفاده گردند. برای کشت گونه مایکوباکتریوم بویس (M.bovis)، گلیسرول حذف می شود و پیروات سدیم اضافه می گردد. این محیط ظاهری سبز، مات و کدر دارد.

 – موارد استفاده :

· برای تشخیص عفونت های مایکوباکتریایی

· برای جداسازی باکتری های حساس به آنتی بیوتیک

·  برای تمایز گونه های مختلف مایکوباکتریوم (با بررسی مورفولوژی کلونی، سرعت رشد، ویژگی های بیوشیمیایی و میکروسکوپی)

معایب کشت مایکوباکتریوم

• کشت باکتری ها برای آزمایش سل بسیار پیچیده تر و گران تر از تهیه اسمیر از خلط و مشاهده میکروسکوپی آن می باشد. این امر به این دلیل است که کشت باکتری نیاز به تجهیزات و امکانات آزمایشگاهی خاص دارد. آزمایش و تشخیص مایکوباکتریوم عامل سل با استفاده از کشت، می تواند به دلیل رشد آهسته باکتری های سل هفته ها به طول انجامد.
• به طور متوسط نتیجه آزمون قابل اعتماد کشت باکتری های سل، با استفاده از روش های رایج، ۴ هفته طول می کشد. همچنین مدت زمان۴ تا ۶ هفته دیگر برای کسب نتایج مقاومت دارویی نیاز می باشد. یکی از راه های کاهش زمان، استفاده از محیط های کشت مایع می باشد. در حال حاضر دستگاه های اتوماتیک برای کشت باکتری ها وجود دارد.

*تجویز درمان حدا قل به مدت ۱۴ روز**دو هفته پس از اولین سری آزمایش خلط انجام می شود

؟ چنانچه بیمار در ابتدا سه گسترش خلط منفی داشته باشد و پس از تجویز آنتی بیوتیک وسیع الطیف بهبود نیافته باشد و در آزمایش مجدد خلط از سه نمونه گسترش وی فقط یک نمونه مثبت شده باشد جهت ثبت به عنوان گسترش مثبت نیازمند رادیوگرافی منطبق با سل ریوی است

۸-۴) سیستم بک تک اسید فست (Bactec AFB system)

سیستم رادیومتریک بک تک ، امکان جداسازی سریع باکتری های اسید فست را به وجود می آورد. با استفاده از این سیستم ، مدت زمان لازم برای رشد گونه های  NTMکمتر از ۷ روز به طول می انجامد. همچنین مدت زمان رشد اعضای کمپلکس مایکوباکتریوم ۱۴-۹ روز کاهش می یابد. محدودیت سیستم  های بک تک عبارتند از : رویت نشدن کلنی باکتری به علت استفاده از محیط کشت مایع ، عدم توانایی در جداکردن سوش های مختلف دریک نمونه ، آلودگی محیط کشت ، هزینه بالا و مواد زائد رادیو اکتیو. همچنین به علت استفاده زیاد ازتعداد زیادی سوزن درتلقیح کشت ها، احتمال آلوده شدن پرسنل افزایش می یابد. به منظور مشاهده کلنی سوش ها ، از محیط کشت مایع مثبت به محیط جامد منتقل می شوند. از این سیستم در تعیین حساسیت دارویی سریع نیز استفاده می شود.

۹-۴) سیستم MGIT (mycobacteria growth indicator tube) 

سیستم MGITاز یک لوله شیشه ای تشکیل شده است که حاوی ۴ ml از محیط کشت مایع میدل بروک ۷H9 با معرف فلورسنت سیلیکون (silicon) در ته لوله است. معرف وابسته و غنی شده با اکسیژن می باشد ودر ته لوله قرار گرفته است. با رشد باکتری ، مقدار اکسیژن در لوله کاهش یافته و در مقابل نور ماورابنفش ، رنگ براق زرد روشن در ته لوله و سطح محیط مشاهده می شود. در این سیستم برای جلوگیری از رشد باکتری های آلوده کننده ، مخلوط آنتی بیوتیکی  Michison به محیط اضافه می شود. همچنین برای تسهیل رشد مایکوباکتریوم ها ، مواد غنی کننده OADC به محیط اضافه می گردد. انکوباسیون به مدت ۸ هفته  در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انجام می شود. مطالعات مختلف نشان می دهد حساسیت این سیستم مشابه بک تک است ولی به زمان طولانی تری برای رشد باکتری نیاز است. گرچه میزان آلودگی MGIT از بک تک بیشتر است ولی مزایایی دارد که عبارتند از : استفاده نکردن از سوزن درتلقیح نمونه ، عدم استفاده از مواد رادیو اکتیو و عدم نیاز به تجهیزات گران قیمت .از معایب سیستم MGIT ، آلودگی و ماسکه شدن نور فلورسانس به وسیله نمونه های حاوی خون است. متد های تعیین حساسیت دارویی MGIT درحال توسعه است.

۱۰-۴) محیط های کشت بی فازیک (Biphasic media) 

سیستم بی فازیک septi-chek media که مشابه محیط های کشت بی فازیک خون است حاوی یک محیط مایع میدل بروک ۷H9 ومحیط های جامد شامل لوین اشتاین جانسن اصلاح شده ، میدل بروک ۷H11 و شکلات آگار می باشد .آلودگی محیط کشت توسط شکلات آگار کنترل می شود. نمونه بعد از آلودگی زدایی و هضم ، به بطری حاوی محیط کشت مایع تلقیح شده و برای تماس با محیط های جامد ، سیستم بعد از ۲۴ ساعت وارونه می شود. سیستم دراتمسفر CO2 20% به مدت ۸ – ۶ هفته در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه می شود. قبل از رشد مواد غنی کننده و مهار کننده آلودگی از جمله گلوکز، گلیسیرین، اسیداولئیک، پیروکسیدال HCL، کاتالاز، آلبومین، پلی میکسین B، تری متوپریم  و … اضافه می شود. حساسیت این سیستم مشابه سیستم بک تک است ولی زمان لازم برای رشد مایکوباکتریوم ها طولانی تر می باشد.

سیستم های پیشرفته خودکاری که در آنها از مواد رادیواکتیو استفاده نشده است عبارتند از :

سیستم های Bactec 9000MB ، EPS II ، MB/bac T سیستم Bactec 9000MB مشابه سیستم MGIT است.از آنجاییکه تولید بعضی گازها و مصرف اکسیژن نشان دهنده رشد میکروارگانیسم هاست ، در سیستم EPS II تغییرات فشار گاز فضای بالای لوله محیط مایع اندازه گیری می شود. در سیستم MB/bac T رشد مایکوباکتریوم ها باعث تولیدCO2 می شود. درنتیجه رنگ سبز ته لوله به زرد تبدیل می شود. در این سیستم ها از محیط کشت  مایع میدل بروک ۷H9 استفاده می شود.

در این سیستم ها به علت کاهش میزان آلودگی متقاطع ، کم شدن فشار کار آزمایشگاه، نبودن مواد رادیواکتیو و ارزشیابی بیشتر نتایج نسبت به روش های رادیو متریک ارجحیت دارند.

۱۱-۴) تست های فنوتیپیک مایکوباکتریوم 

برای شناسایی و متمایز نمودن مایکوباکتریوم ها به تست های بیوشیمیایی اختصاصی نیاز می باشد.  سال ۱۹۷۴ و ۱۹۷۶ کارگروه بین المللی برای طبقه بندی مایکوباکتریوم (IWGMT) یازده تست بیوشیمیایی را برای طبقه بندی مایکوباکتریوم ها ارائه نمود که در سال های بعد از این تست ها برای شناسایی و متمایز نبودن گونه های مایکوباکتریوم استفاده گردید. این یازده تست حداقل تست های بیوشیمیایی لازم برای معرفی گونه های جدید نیز به شمار می روند.

بررسی رشد در دماهای ۴۵ ،۴۰ ، ۳۷ ،۳۳ ،۳۰ ، ۲۵  تولید پیگمان، تست مقاومت به ایزونیازید ۱و ۱۰ میکروگرم در هر میلی لیتر، بررسی حساسیت به تیوفن کربوکسیلیک هیدرازید، تست هیدرواکسیلامین، تست نیتروبنزوئیک اسید، تست تحمل نمک ، تست مصرف پیکرات، تست کاتالاز(به دو صورت کیفی و کمی )، تست هیدرولیز توئین، تست اوره از، تست نیترات، تست نیاسین، تست آریل سولفاتاز و تست پیرازینامیداز تعدادی از مهم ترین تست های بیوشیمیایی مذکور می باشد.

۱۲-۴) تست های مرسوم بیوشیمایی برای تعیین هویت مایکوباکتریوم ها 

تست تولید پیگمان : مایکوباکتریوم ها با توجه به نوع گونه ، دارای قدرت تولید پیگمان کارتنوئید در مقادیر و انواع مختلف می باشند. براین اساس مایکوباکتریوم ها به سه دسته فتوکروموژن، اسکوتوکروموژن و غیر کروموژن تقسیم می شوند. بررسی قدرت تولید پیگمان برروی مایکوباکتریوم ها دارای کلنی های تک مشاهده می گردید.

فتوکروموژن ها : مایکوباکتریوم هایی می باشند که در حضور نور تولید کلنی های پیگمان دار می نمایند. مایکوباکتریوم کانزاسی یک گونه فتوکروموژن ها می باشد که پیگمانی به رنگ زرد تولیدمی کند.

اسکوتوکروموژن ها : مایکوباکتریوم هایی می باشند که در حضور نور و تاریکی تولید کلنی های پیگمان دار می نمایند.

غیرکروموژن ها : مایکوباکتریوم هایی می باشند که تولید پیگمان در آنها تحت تاثیر نور قرار نمی گیرد. مایکوباکتریوم توبرکلوزیس یک گونه غیر کروموژن است.

۱۳-۴) تست هیدرولیز توئین

از این تست برای تفکیک گونه های بیماری زایی که اغلب دارای تست منفی هستند از تست مایکوباکتریوم هایی که دراین تست مثبت هستند استفاده می شود.

۱۴-۴) آزمایش اوره از 

برای شناسایی و جداسازی گونه های اسکوتوکروموژن ها و غیرفتو کروموژن، توانایی برخی از مایکوباکتریوم در هیدرولیز اوره  و آزاد سازی آمونیاک و آب مفید است.

۱۵-۴) تست نیاسین

نیاسین یکی از ویتامین های گروه B می باشد که همه مایکوباکتریوم ها آن را تولید می کنند. تعدادی از گونه های مایکوباکتریوم مانند مایکوباکتریوم سیمیه و مایکوباکتریوم توبرکلوزیس فاقد آنزیم لازم برای تبدیل نیاسین ریبونوکلئوتید هستند. براین اساس  تجمع نیاسین در محیط کشت برای شناسایی گونه های مایکوباکتریوم به خصوص مایکوباکتریوم توبرکلوزیس اهمیت دارد.

۱۶-۴)  تست پیرازینامیداز

مایکوباکتریوم بویس، دارای مقاومت ذاتی نسبت به پیرازینامیداز است. گونه هایی که نسبت به پیرازینامیداز حساس هستند با آنزیم پیرازینامیداز ، آن را تبدیل به اسید پیرازینوئیک تبدیل
می کنند.

۱۷-۴) تست تحمل نمک 

توانایی رشد مایکوباکتریوم ها در حضور نمک طعام ۵% یا تحمل آن متفاوت است.  مایکوباکتریوم های تند رشد به جز .mucogenicum  Mدر محیط کشت حاوی نمک طعام ۵% می توانند رشد  کنند. همچنین اغلب سوش های مایکوباکتریوم کلنی قادر به رشد دراین محیط می باشند.

 .triviale   Mتنها گونه ای از کند رشد ها است که توانایی رشد در این محیط را دارد.

۱۸-۴)  تست احیای نیترات 

تعدادی از مایکوباکتریوم ها به خصوص مایکوباکتریوم توبرکلوزیس قادرند نیترات را به نیتریت احیا نمایند. آزمایش احیا نیترات برای تشخیص مایکوباکتریوم کانزاسی ، مایکوباکتریوم زولگایی و مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و همچنین بعضی از سویه های غیر مرتبط با بیماری در فتوکروموژن ها با ارزش است. مایکوباکتریوم فورچیتوم ، مایکوباکتریوم بویس، مایکوباکتریوم گاستری و مایکوباکتریوم مالموئنسی و مایکوباکتریوم چلونه ای منفی یا مثبت یا خیلی ضعیف هستند.

۱۹-۴) تست کاتالاز 

کاتالاز یک آنزیم محلول داخل سلولی است که قادر به شکستن پراکسید هیدروزن به آب و اکسیژن می باشد. وجود حباب در مخلوط واکنش نشانه مثبت بودن تست است. مایکوباکتریوم ها دارای چندین آنزیم کاتالاز می باشند که از نظر حساسیت به گرما با هم متفاوتند.

۲۰-۴) کاتالاز نیمه کمی

آزمایش کاتالاز نیمه کمی ارزش زیادی در جداسازی بعضی گونه های مایکوباکتریوم ها دارد. مایکوباکتریوم گاستری ، مایکوباکتریوم آویوم کمپلکس ، مایکوباکتریوم مارینوم ، مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، مایکوباکتریوم هموفیلوم، مایکوباکتریوم زنوپای ، مایکوباکتریوم بویس تولید ستونی از حباب کمتر از ۴۵ میلی متر می کنند اما گونه های دیگر ستون بلند تری از حباب تولید می کنند.

۲۱-۴) تست آریل سولفاتاز

آنزیم آریل سولفاتاز ، موجب تجزیه فنل فتالئین دی سولفات شده و آن را به فنل فتالئین تبدیل می کند که در حضور بیکربنات سدیم رنگ قرمز تولید می کند.دربعضی از جمله مایکوباکتریوم زنوپای ، مایکوباکتریوم آزیاتیکوم، مایکوباکتریوم فورچیتوم، مایکوباکتریوم مارینوم، مایکوباکتریوم زولگایی، مایکوباکتریوم  فلاوسنس آنزیم آریل سولفاتاز وجود دارد.

۲۲-۴) رشد مایکوباکتریوم ها در دماهای مختلف

مایکوباکتریوم ها از نظر دمای رشد با یکدیگر متفاوت هستند. اعضای  کمپلکس مایکوباکتریوم در دماهای ۳۵-۳۷ درجه سانتی گراد به راحتی رشد می کنند ولی مایکوباکتریوم زنوپای فقط در دماهای ۴۲-۴۴ درجه سانتی گراد رشد می کند. بهترین دمای رشد مایکوباکتریوم مارینوم ۳۰ درجه سانتی گراد و در دماهای بالاتر از ۳۳ درجه سانتی گراد رشد نمی کند. مایکوباکتریوم فورچیتوم در دماهای ۴۲-۲۵ درجه سانتی گراد به خوبی رشد می کند. همچنین مایکوباکتریوم اسکروفولاسئوم در دماهای ۲۵ درجه سانتی گراد به آهستگی رشد می نماید. برای تعیین دمای رشد سوش مورد نظر را در محیط لون اشتاین جانسون تلقیح کرده و در دماهای ۴۵ ،۴۰ ، ۳۷ ،۳۳ ،۳۰ ، ۲۵درجه سانتی گراد انکوبه می کنند.

۲۳-۴ ) مورفولوژی کلنی

مورفولوژی کلنی گونه های مایکوباکتریوم در سطح محیط کشت جامد متفاوت است. اعضای کمپلکس مایکوباکتریوم کند رشد هستند و دارای کلنی های خشن ، خشک و بی رنگ هستند ولی کلنی های اعضای NTM اغلب نرم وصاف هستند.

۲۴-۴) بررسی حساسیت به تیوفن کربوکسیلیک هیدرازید 

به منظور تفکیک مایکوباکتریوم بویس از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و سایر مایکوباکتریوم های غیر فتوکروموژن ها کند رشد ، از این تست استفاده می شود. اغلب سوش های مایکوباکتریوم بویس در غلظت های L/mg5-1نسبت به TCH حساس می شوند. سویه های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم آفریکانوم در غلظت های L/mg5 نسبت به TCH مقاوم هستند.

۵)  تکنیک های نوین در مایکوباکتریولوژی تشخیصی

استفاده از روش های متداول در تشخیص بیماری سل به زمان طولانی نیاز دارد، لذادر سال های اخیر تلاش های فراوانی در ارائه روش ها و تکنیک های سریع تشخیصی به عمل آمده است که از جمله می توان به روش های تشخیصی مولکولی، سرولوژیک و رادیومتریک اشاره کرد. علی رغم جذابیت روش های مولکولی ، تازمانی که میزان حساسیت و ویژگی این تکنیک ها به حد قابل قبولی نرسیده است، این روش ها نمی توانند جایگزین مناسبی برای روش های رایج باشند.

۱-۵) روش های تشخیصی مولکولی

روش های تشخیصی مولکولی به علت دارا بودن سرعت بالا جایگاه مهمی در تکنیک های تشخیصی نوین دارند. کاربرد این تکنیک ها در بیماری هایی مانند مننژیت از اهمیت خاصی برخوردار است. اصول تشخیص در روش رایج ، براساس خصوصیات فنوتیپیک مایکوباکتریوم ها استوار است ولی محور اصلی تشخیص در روش های مولکولی ، ویژگی های ژنتیکی میکروارگانیسم ها می باشد. بدین منظور روش های متعددی برای تکثیر اسیدهای نوکلئیک در شرایط آزمایشگاهی توسعه یافته است که در ادامه به مواردی اشاره می شود.

۲-۵) شناسایی و تعیین هویت گونه های مایکوباکتریوم براساس روش های مولکولی

علایم کلینیکی بیماری های ناشی از مایکوباکتریوم های غیر سلی از بیماری سل قابل تفکیک نمی باشد. برای تشخیص بدون ابهام عفونت مایکوباکتریوم های غیر سلی و برای درمان مناسب این گونه عفونت ها ، جداسازی و تعیین هویت مایکوباکتریوم های غیر سلی لازم می باشد. مارکر های زیادی برای شناسایی گونه های مایکوباکتریوم ها مورد بررسی قرار گرفته اند که در ادامه به تعدادی از این مارکر ها و توانایی هر کدام به صورت اجمالی اشاره می گردد.

۳-۵) تست هاي آمپليفيكاسيون اسيد نوكلئيك

با روش ( NAATs) Nucleic acid amplification tests تشخيص مولكولي مقادير اندك ماده ژنتيكـي DNA يا RNA ميكروارگانيسم ها به وسـيله آمپليفيكاسـيون امكـانپذيراسـت كه شـامل واكـنش زنجيـره اي پلـيمـراز PCR يـا probe acid Nucleic مي باشد. حساسيت و اختصاصيت  NAATs  براي نمونه هاي اسميرمثبت بالاي ۹۵% است ، اما براي نمونه هاي اسمير منفي حساسيت پايين تر می باشد . ايـن روش هـا بـه عنـوان تسـت تكميلـي جهـت تشـخيص سـل اسـتفاده مـي گـردد ولـي هـيچگـاه جـايگزين اسـميرو كشـت نمي باشد . برای تشخیص مننژيــت ســلي و ســل پلــور ايــن روش آزمايشــگاهي بســيار كمــك كننــده مي باشد.

۴-۵) (Loop-mediated isothermal amplication (LAMP

تكنيك تكثير هم دمـا بـه واسـطه حلقـه LAMP) ) روشي سريع، حساس و ساده براي تكثير اسيد نوكلئيك مي باشد كه قادر است DNA هدف را تحت شرايط هم دمـا و بـا استفاده از ۶ پرايمر اختصاصي تكثير كنـد. در این روش  ۶ پرايمـر اختـصاصي كـه ۸ تـوالي مجـزا را روي تـوالي هـدف شناسـايي مي كنند استفاده شده که  ويژگي و حساسيت اين تكنيك را افزايش مي دهـد. بـر خلاف PCR واكنش LAMP نيـاز بـه ترموسـايكلر نداشـته و بـا استفاده از بن ماري يـا  heater سـاده صـورت مي گيرد. اين واكنش قادر است از يك كپي  DNAتعداد زیادی كپي در كمتر از يـك سـاعت توليـد كند و محصولات تكثيري حاصل با چشم غير مسلح و بدون نيـازبه الکتروفورز می باشد. اما مـساله اصـلي در ارتبـاط بـا LAMP  خطر بالاي توليد محصولات ثانويه  و آلودگي محيطـي به دليل كارايي بسيار زياد اين روش در تكثير است.

۵-۵) PCR based sequencing  

PCR مبتنی بر توالی یکی از موثرترین روش ها  برای شناسایی مایکوباکتریوم است . این روش شامل تقویت DNA با پرايمرهای اختصاصی جنس است. در این روش  ، توالی نوکلئوتیدی ارگانیسم  با توالی های مرجع مقایسه و شناسایی  می شود. این روش شناسایی  گونه هایی  که توانایی رشد در محیط های آزمایشگاهی امکان پذیر می شود. امروزه با استفاده از این تکنیک چندین گونه جدید شناسایی شده است. توالی  مورد استفاده ژن کدگذاری S rRNA  ۱۶می بوده که  این توالی در تمام گونه های باکتری موجود است و حاوی هر دو منطقه محافظت شده و متغیر است، همچنین  یک هدف ایده آل برای طبقه بندی می باشد.در جنس مایکوباکتریوم توالی S rRNA  ۱۶ بسیار  محافظت شده ودر بین تمامی اعضا این جنس مشترک می باشد با وجود این ، مناطق متغیر موجود در این توالی می تواند به خوبی برای افتراق گونه های مایکوباکتریوم به کار رود. با به دست آوردن توالی S rRNA   ۱۶مربوط به هر مایکوباکتریوم و مقایسه آن با توالی های ذخیره شده در بانک های اطلاعاتی موجود ، می توان به گونه مایکوباکتریوم پی برد. بزرگترین چالش استفاده از ژن S rRNA  ۱۶برای شناسایی گونه ها، وجود هترو ژنیسیتی های کوچکی بین اپرون های مختلف rrm  در  ژنوم یک ایزوله می باشد که این پدیده می تواند آنالیز اطلاعات را بسیار گیج کننده و پیچیده نماید. البته استفاده از این ژن محدودیت هایی دارد به عنوان مثال، مایکوباکتریوم کانزاسی دارای یک توالی است که مشابه گونه های غیر پاتوژن مایکوباکتریوم  گاستری است. HSP65 یکی از ژن های مرسوم خانه دار کد کننده پروتئین شوک حرارتی ۶۵ کیلو دالتونی در سلول ها می باشد که با دیگر ژن های مشابه از لحاظ عملکردی ، در کنترل عملکرد سلول در زمان شوک حرارتی و دیگر استرس های محیطی نقش دارد. پروتئین شوک حرارتی یکی از مهم ترین اجزای آنتی ژن های سطحی در تعدادی از باکتری های بیماری زا از جمله مایکوباکتریوم  باشد. گونه های مایکوباکتریوم دارای یک کپی از ژن مذکور می باشند.این ژن در جنس مایکوباکتریوم بسیار محافظت شده است.

گونه های مایکوباکتریوم به ویژه انواع تند رشد دارای شباهت بسیار بالایی در سطح توالی  ژن

S rRNA  ۱۶ می باشند لذا شناسایی مولکولی آنها در مواردی همانند گونه های متعلق به کمپلکس مایکوباکتریوم فورچیتوم کار دشواری می باشد. ژن  rpoB دارای طولی بیش از ۳۰۰ جفت باز می باشد و دارای هفت ناحیه متغیر می باشد که دارای ارزش بالایی در شناسایی گونه های باکتری از جمله مایکوباکتریوم ها می باشد. dnaK ،rpoBC ، glpK ، murC نیز از دیگر ژن های کاربردی برای برای شناسایی گونه های مایکوباکتریوم به کار می روند.

۶-۵) Real-Time PCR 

با توجه به دقت، سرعت، حساسیت و پتانسیل بالايReal Time PCR  از این روش برای تشخیص سریع باکتری و مقاومت دارویی مایکوباکتریوم در نمونه های بالینی  استفاده می شود. پروب های متفاوت مانند پروب TaqMan، پروب های (FRET) fluorescence resonance energy   bioprobes استفاده می شود. مزایای اصلی استفاده از این تکنیک سرعت آزمون و خطرآلودگی کمتر است اما  تجهیزات گران قیمت و نیاز به  پرسنل فنی ماهر نیز از معایب این تکنیک می باشند.

۷-۵) ( High Resolution Melting (HRM 

تکنیک HRM جهت شناسایی و تفکیک گونه های شایع مایکوباکتریوم براساس تفاوت در دمای ذوب ژن هدف است. در واقع آنالیز HRM به تکنیک آنالیز قطعات DNA اطلاق می شود که شامل تعیین دقیق ارتباط بین دمای ذوب آنها می شود. این تکنیک با استفاده از دستگاه Real Time PCR  انجام می گیرد.

۸-۵) DNA Probe Hybridization  

DNA Probe Hybridization  یکی از بهترین روش های تشخیصی مولکولی برای شناسایی ارگانیسم های اسید فست می باشد.  (Gen-Probe  ,San Diego , CA)Accuprobe روش مبتنی بر DNA خاص که از rRNA  هیبرید می شود ، برای شناسایی تعداد محدودی از مایکوباکتریوم، از جمله. مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ، مایکوباکتریوم کانزاسی ، مایکوباکتریوم گوردونه ای استفاده می شود. پروب ها به طور گسترده در یک محیط بالینی ارزیابی شده اند و حساسيت و اختصاصیت بالا در دو ساعت نتیجه را  نشان می دهد.

به طور کلی، برای جداسازی کمپلکس  مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حساسیت و اختصاصیت  پروب های DNA ، ۹۹٪ است. برای جداسازی کمپلکس  مایکوباکتریوم آویوم حساسیت و اختصاصیت به ترتیب  ۹۵٪ ، ۹۹٪ می باشد. به طور نادر اما واکنش  متقاطع بین  پروب  کمپلکس  مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و پروب های M. terrae و M. celatum و M. avium و همچنین گونه های اخیرا توصیف شده اند  M. palustre ،  M. parascrofulaceum  و M. saskatchewanense نیز ممکن است رخ بدهد.

۹-۵) GeneXpert  

متد GXpert (R) MTB / RIF به طور همزمان مایکوباکتریوم توبروکلوزیس و مقاومت در برابر ریفامپیسین (RIF) را شناسایی می کند. این سیستم بر اساس Real-time nested PCR می باشد. این سیستم به پزشکان  کمک می کند تا بیماری را در در کمتر از ۲ ساعت تشخیص داده و به شروع به موقع درمان کمک می کند.

۱۰-۵) روش های تشخیصی سرولوژیک

به منظور تشخیص بیماری سل براساس نتایج پاسخ ایمنی میزبان به میکروارگانیسم عامل ، آزمایش های متعددی توصیف شده است.آزمایش پوستی توبرکولین قدیمی ترین آزمایش ایمونولوژیک در تشخیص بیماری سل می باشد. بزرگترین ایراد این تست، عدم توانایی در جداسازی شکل فعال بیماری از شکل غیر فعال آن است.

۱۱-۵) تست پوستی PPD

بعد از تحریک ایمنی سلول در برابر مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، هر گونه تماس بعدی با این میکروارگانیسم سبب واکنش ازدیاد حساسیت تاخیری لوکالیزه (موضعی) (ازدیاد حساسیت تیپ IV) می شود. تزریق داخل پوستی  ذرات پروتئيني آنتی ژنیک حاصل از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس های کشته شده به نام)  PPD ( Purified Protein Derivative  موجب تورم و قرمزی موضعی ( در محل تزریق ) و پوست می گردد. بنابراین تزریق داخل جلدی PPD معلوم می کند که آیا یک فرد با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس آلوده شده است یا نه. این آزمایش از این حیث مهم است که بسیاری از افراد آلوده هیچ علامت بالینی را تا چند سال نشان نمی دهند. زمانی که تست PPD مثبت شود، می توان بیماری را درمان نموده و بیماری را قبل از آن که به طور قابل توجهی به ریه ها و سایر ارگان ها آسیب برساند ریشه کن نمود . یک تست PPD مثبت با یک ناحیه ي سفت  پوست که قطره آن بیش از ۱۰mm باشد بعد از ۴۸ ساعت مشخص می گردد درست  زمانی که طول می کشد  یک واکنش ازدیاد حساسیت تیپ IV رخ دهد. در بیمارانی که سيستم ایمنی آن ها سرکوب شده نظیر افراد مبتلا به AIDS سفتی با قطر ۵ میلی متر نشان دهنده پاسخ تست مثبت است. دقت داشته باشید که تست مثبت بدین معنا نیست که فرد توبرکلوزیس فعال دارد بلکه نشان دهنده ی مواجهه و عفونت با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در گذشته می باشد. تست مثبت در بیماران با عفونت فعال ، عفونت پنهان و افراد درمان شده نیز بوجود می آید.

– تست مثبت کاذب : همچنان باید برای تفسير این تست با ملاحظه باشید زیرا بعضی افراد از ساير کشورها با واکسن BCG) Bacillus Colmette – Guerin ) برای توبرکلوزیس واکسینه شده اند. این واکسن برای پیشگیری از توبرکلوزیس بسیار موثر می باشد اما سبب پاسخ مثبت به تست PPD می گردد.

– تست منفی کاذب : بعضی افراد هستند که علی رغم آلودگی به توبرکلوزیس به تست PPD واکنش نشان نمی دهند. این بیماران معمولا دچار آنرژی ( بی پاسخی ) شده اند یعنی به دلایلی نظیر مصرف استروئید ، سوء تغذیه ایدز و … فاقد پاسخ ایمنی طبیعی می باشند. برای مشخص کردن اینکه آیا یک فرد آنرژیک است یا اینکه تا بحال با توبرکلوزیس آلوده نشده است، تزریق دومی ( با آنتی ژن کاندیدا یا اريون ) را در بازوی دیگر فرد انجام می دهیم. بسیاری از افراد با این آنتی ژن ها مواجهه گشته اند لذا تنها اشخاصی که آنرژیک هستند به تزریق کاندیدایا اريون بعد از ۴۸ ساعت با سفتی پاسخ نخواهند داد.

۱۲-۵) تست خونی IGRA در تشخیص مایکوباکتریوم توبرکلوزیس 

اخيرا تستي به نام  Assay Release Gamma Interferon Gamma Release Assay  (IGRA)  براساس سنجش گاما اينترفرون مترشحه جهت تشخيص بيماري سل راه اندازي شده و مورد تائيد سازمان غذا و دارو اياالت متحده FDA قرار گرفته استIGRA  روشي است كه در آن پاسخ ايمنـــي سلولار به برخــي از آنتي ژن هاي اختصاصـي مايكوباكتريــوم مورد ارزيابي قـرار مي گيرد. در حال حاضردو روش IGRA براي ارزيابي آنتي ژن هاي مربوط به منطقه تمايز  (RD1) ژنوم مايكوباكتريوم جهت تشخيص سل وجود دارد. روش اول كوانتي فرون (QFT )ناميده مي شود كه در آن ميزان اينترفرون گاما مترشحه به توسط سلولهاي T فعال شده اندازه گيري مي شود. در روش دوم به نام( SPOT-T )سلول هاي T فعال شده كه γ-INF ترشح مي كنند مورد شمارش قرار مي گيرنــد. هر دو روش مورد تائيــد FDA مي باشند. کوانتی فرون ( QFT )در واقع یک روش غیر مستقیم برای تشخیص بیماری فعال و همچنین نهفته سل محسوب می گردد. تست QFT از متدولـوژی ساده ای برخوردار است و اساس آن بر پایه شناسائی پروتئین های اختصاصـی باسیـل ســل  می باشد. این پروتئین ها در BCG و سایر مایکوباکتریوم های غیر توبرکلوزی وجود ندارند. بنابراین شاخص های بسیار دقیق برای تشخیص باسیل سل محسوب می شوند. به کارگیری پروتئین های اختصاصی باسیل سل باعث شده است که این تست از اختصاصیت  بالایی در تشخیص افراد آلوده به سل برخوردار باشد.

۱۳-۵) رادیوگرافی

تشخیص قطعی بیماری سل به خصوص سل ریوی ، مشاهده یا جداسازی باسیل سل از نمونه بیمار می باشد. لذا رادیوگرافی در این تشخیص ، نقش مهمی ایفا نمی کند زیرا در بیماری های ، علائم مشابه مشاهده می شوند. همچنین سل ریوی ، تصویر رادیولوژیک مختلفی دارد. از طرفی امکان تشخیص بیماریها ی فعال از عفونت نهفته ، با علائم رادیولوژیک ریوی وجود ندارد. ولی در مواردی مانند سل در کودکان و بالغین جوان مبتلا به سل ارزنی وسل خارج ریوی رادیوگرافی می تواند کمک کننده باشد.

۶ ) آزمایش های مقاومت دارویی

یکی از مهم ترین وظایف آزمایشگاه های مرکزی مایکوباکتریولوژی انجام آزمایش های مقاومت دارویی است. انجام آنتی بیوگرام درارزیابی و شیوع مقاومت دارویی در یک منطقه ، همچنین کنترل بیماری های مایکوباکتریایی و در صورت بروز مقاومت دارویی، تصحیح رژیم دارویی در پروسه درمان و تولید داروهای موثر جدید  نقش مهمی را ایفا می کند. اصل آنتی بیوگرام برپایه مفاهیم حداقل غلظت مهارکننده MIC (Minimal inhibitory Concentration) و حداقل غلظت کشنده MBC (Minimal Bactericidal Concentration) استوار است. با انجام این آزمایش ، مقاومت فرد به داروهای ضد سل مشخص می شود. آزمایش مقاومت دارویی شامل کشت باکتری های سل در حضور داروهای ضد سل می باشد. اگر باکتری رشد کند ، به این معنی است که باکتری ها به داروها  مقاوم هستند. اما اگر باکتری ها رشد نکنند ، بدان معناست که داروها موثر بوده و باکتری ها به آن ها مقاوم نیستند. درآزمایش غیرمستقیم حساسیت دارویی،  مجموعه ای از مواد حاوی دارو به طور همزمان و مستقیم به یک کشت خالص از نمونه تلقیح می شوند. در حال حاضر آزمایشات غیرمستقیم، به عنوان آزمون حساسیت دارویی استاندارد شناخته شده اند. با وجود حساسیت و اختصاصیت این نوع آزمایش ها (کشت و شناسایی مایکوباکتریوم عامل سل) ، اما مشکل عمده  مدت زمان انجام و تجهیزات مورد نیاز برای آن ها می باشد.

۱-۶) انجام آزمایش تعیین حساسیت دارویی

– روش مستقیم 

در مناطقی که مقاومت دارویی شایع است ، آزمایش های تعیین حساسیت دارویی را می توان با روش مستقیم انجام داد.چنانچه نتیجه سریع آزمایش لازم باشد روش مسقیم استفاده می شود. سازمان بهداشت جهانی ، انجام آزمایش های تعیین حساسیت دارویی با روش مستقیم به علت تکرار تست با روش غیر مستقیم توصیه نمی کند.

– روش های غیر مستقیم 

۱- روش نسبت مقاومت (Resistance ratio Method)

۲- روش غلظت مطلق ( Absolute concentration Method)

۳- روش دیسک دیفیوژن (Disc Diffusion Method)

۴-روش رادیو متریک (Radiometric Method)

۵- روش  نسبی (proportial Method)

۲-۶) روش نسبت مقاومت  ( (Resistance ratio Method(RR)

این روش بیشتر در کشور انگلستان به کار می رود، MIC دارو برای سوش آزمایش و سوش استاندارد به طور همزمان تعیین می شود. سپس MIC دارو برای سوش مورد آزمایش را بر MIC دارو برای سوش استاندارد تقسیم کرده و نسبت مقاومت را محاسبه می کنند. اگر RR برابر یا بزرگتر از ۴ (RR≥۴) باشد ، سوش مورد آزمایش مقاوم تلقی می شود ، در این روش ،  غلظت  آنتی بیوتیک ها برای سوش مورد آزمایش سوش استاندارد متفاوت است.

۳-۶) روش غلظت مطلق

این روش بسیار شبیه به روش نسبت مقاومت است و مزیتی نسبت به آن ندارد. روش غلظت مطلق

در بعضی از کشور های اروپایی استفاده می شود و متد های اتو ماتیک آن نیز طراحی شده است.

۴-۶) روش غلظت مطلق با متد میکرودایلوشن 

ازاین متد در تعیین MICآنتی بیوتیک مختلف برای تمامی مایکوباکتریوم ها از جمله مایکوباکتریوم توبرکلوزیس می توان استفاده کرد.با توجه به میزان کدورت ، میزان رشد باکتری در چاهک ها با چاهک های شاهد مقایسه می کنند.در این روش MIC ، کمترین غلظت دارویی است که در آن کدورت قابل تشخیص وجود ندارد.

۵-۶)روش دیسک دیفیوژن

اولین بار از روش دیسک دیفیوژن برای بررسی مقاومت باسیل سل نسبت به ایزونیازید و استرپتومایسین استفاده شد. دراین روش ، دیسک های کاغذی آغشته به آنتی بیوتیک را روی محیط های کشت داخل ظرف پتری که قبلا با سوش مورد آزمایش و سوش استاندارد تلقیح شده اند، قرار می دهند. مقدار آنتی بیوتیک موجود در دیسک ، ۵ برابر مقدار لازم در محیط است تا میزان دارو را در محیط کمتر از غلظت مورد نظر نباشد. محیط کشت مورد استفاده بیشتر میدل بروک ۷H11 است.

۶-۶) روش رادیو متریک 

روش رادیو متریک ، روش جدید است که سیستم بک تک مورد استفاده قرار می گیرد. ازاین روش بیشتر در ایالات متحده آمریکا برای تمامی دارو های ضد سل استفاده می شود.

در سیستم بک تک ، آنتی بیوگرام با اضافه کردن پودر های لیوفیلیزه دارو در محیط B12انجام می شود. معایب این روش وجود مواد رادیواکتیو و بروز آلودگی می باشد. اگر میزان رشد سوش مورد آزمایش در محیط حاوی آنتی بیوتیک نسبت به محیط شاهد بیشتر از ۱% باشد ، سوش مقاوم محسوب می شود.

۷-۶) روش  نسبی 

روش  نسبی میزان رشد سوش در محیط های حاوی آنتی بیوتیک با محیط کشت بدون آنتی بیوتیک مقایسه می شود. اگر میزان رشد باکتری در محیط های حاوی آنتی بیوتیک بیشتر از ۱% محیط بدون آنتی بیوتیک باشد ،  سوش مقاوم محسوب می شود. روش  نسبی روش ساده است  و مورد تایید سازمان بهداشت جهانی می باشد.

۸-۶) (Epsilometer test (E-TEST 

E-TEST از سایر تکنیک های مورد استفاده که اخیرا کاربرد زیادی در تعیین مقاومت دارویی باکتری ها از جمله مایکوباکتریوم پیدا کرده است. E-TEST از نواری با غلظت های مختلفی از دارو تشکیل شده است که در این روش ، آنتی بیوتیک موجود در نوار در محیط کشت تلقیح شده با باسیل انتشار یافته و رشد باکتری را مهار می کند. با توجه به کمترین مقدار غلظت دارویی نوار که موجب مهار رشد باکتری شده است ،MIC اندازه گیری می شود.

منابع برگزیده:

•  اصول مایکوباکتریولوژی – تالیف عبدالناصر رفیع، رضا مودب
• Woods GL. Susceptibility testing of mycobacteria, nocardiae, and other aerobic actinomycetes. Approved Standard M24-A2.  no. 5 (2011).
• List of prokaryotic names.http://www.bacterio.net/mycobacterium.html
• Tortoli E. Microbiological features and clinical relevance of new species of the genus Mycobacterium. Clinical microbiology reviews. 2014;27(4):727-52.