دستورالعمل نگهداري و استفاده از سويه هاي باكتريايی به روش بلند مدت و كوتاه مدت

هدف:

هدف از تهيه اين دستورالعمل تدوين روش های صحيح و مناسب ذخيره سازی و نگهداری باکتری ها به روش طولاني و کوتاه مدت، و چگونگي استفاده از آنها برای مقاصد مختلف مانند برنامه تضمين کيفيت (ارزيابي کيفي محيط های کشت، معرف ها، ديسک های آنتي بيوتيک و …) انجام آزمايش های تأييدی يا تکميلي (بررسي الگوی مقاومتي سويه ها با آزمايش تعيين حساسيت ضد ميکروبي، بررسي های اپيدميولوژی و …) در بخش ميکروب شناسي آزمايشگاه مي باشد. روش مناسب، روشي است که باکتری بتواند در آن شرايط زنده مانده، ضمن اين که ويژگي هايش حفظ شده و پايدار بماند.

نمونه:

کشت تازه و خالص ميکروارگانيسم روی محيط جامد مناسب

مواد، لوازم و تجهيزات:

محیط محافظت کننده از سرما مانند ۵۰% fetal calf serum، ۱۰% ۰r 15% glycerol در Tryptic Soy Broth (TSB)، یا Skim milk، یا خون دفیبرینه گوسفند
محيط کشت آگار خوندار پليتي
محيط کشت شکالت آگار پليتي
محيط کشت آگار خوندار شيبدار لوله ای درپيچ دار
محيط کشت شکالت آگار شيبدار لوله ای درپيچ دار
محيط کشت Tryptic Soy Broth (TSB) لوله ای درپيچ دار
محيط کشت Cystine Tryptic Agar (CTA) لوله ای درپيچ دار
محیط کشت Brain Heart Infusion Agar (BHIA) شيبدار لوله ای درپيچ دار
محیط کشت Cooked Meat لوله ای در پیچ دار
روغن معدني يا پارافين مايع استريل
ويال های شيشه ای يا پلاستيکي کوچک درپيچ دار استريل
يخچال
فریزر ۷۰- درجه سانتیگراد

روش انجام آزمايش:

نگهداري طولانی مدت (یک سال يا بيشتر):

نگهداری طولاني مدت باکتری ها اين امکان را مي دهد که نمونه ميکروبي، ماه ها و حتي سال ها به صورت زنده باقي بماند. بهترين روش های نگهداری طولاني مدت شامل ليوفيليزاسيون (Freeze Drying)، نگهداری در فريزر (Ultra Low Freezer) -70^◦c یا پایين تر و نگهداری در نيتروژن مايع -۱۹۶^◦cمي باشد.

روش های انتخابي و در دسترس:

۱- نگهداری در فريزر (Ultra Low Freezer) -70^◦c

باکتری مورد نظر را روی محيط مغذی مانند پليت آگار حاوی ۵ %خون گوسفند و در مورد ميکروارگانيسم های سخت رشد )پرنياز (روی محيط شکلات آگار کشت دهيد.
پليت ها را به مدت ۲۴-۱۸ ساعت در دمای ۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد و در صورت نياز برای هر باکتری تحت شرايط CO₂ انکوبه نمایيد.
بعد از انکوباسيون، خالص بودن و مرفولوژی کلني ها را بررسي نموده و در صورت نياز، تست های بيوشيميايي انجام دهيد.
سپس از باکتری رشد يافته، سوسپانسيون غليظي در ۱۰۰-۵۰ میلی لیتر از يک محيط محافظت کننده از سرما (Cryoprotective) تهيه نماييد. اين محيط برای جلوگيری از تخريب سلول های باکتری در شرايط انجماد مورد استفاده قرار مي گيرد.

محيط های محافظت کننده از سرما عبارتند از:

Skim milk
خون دفيبرينه استريل گوسفند يا خرگوش
Tryptic Soy Broth (TSB) حاوی گلیسرول با غلظت نهایی ۱۵-۱۰ %
۵۰% fetal calf serum in broth

از سوسپانسيون باکتريايي فوق به مقدار ۱-۵/۰ میلی لیتر در ويال های شيشه ای يا پلاستيکي کوچک استريل توزيع کنيد. تعداد کافي ويال ذخيره را برای مصرف يک سال آماده نماييد.
بر روی ويال ها برچسب حاوی نام (يا کد) سويه و تاريخ تهيه سوسپانسيون را بچسبانيد. ويال ها را در فريزر ۷۰- تا۵۰- درجه سانتیگراد قرار داده و تا زمان مورد نياز در آن ذخيره نماييد. سويه ها را مي توان در برودت کمتر از ۵۰- درجه سانتیگراد به مدت طولاني نگهداری کرد.
در صورت عدم دسترسي به فريزر ۷۰- درجه سانتیگراد مي توان سويه ها را در فريزر ۲۰- درجه سانتیگراد نيز نگهداری نمود. در اين شرايط توجه به اين نکته ضروری است:
سويه های باکتريايي در اين برودت عمر کمتری (حداکثر يک سال) دارند و ممکن است تعداد زيادی از سلول ها از بين بروند. بنابراين توصيه مي شود برای اطمينان از زنده بودن سويه ها در فواصل چند ماهه، از کشت ذخيره فريز شده، کشت مجدد بر روی محيط مناسب تهيه شود.
در صورت نياز، يک ويال از کشت ذخيره فريز شده را بيرون آورده و محتويات آن را سريعاً زير آب جاری ولرم ذوب نمایيد.
سوسپانسيون را روی محيط آگار خوندار يا شکلاته (در مورد باکتری های سخت رشد) تلقيح نماييد، به گونه ای که کلني های ايزوله رشد کنند. پليت را به مدت ۲۴-۱۸ ساعت در دمای
۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد و در صورت نياز در شرايط CO₂ انکوبه نماييد (ساب کالچر اوليه). قبل از استفاده برای آزمايش، از کشت ذخيره فريز شده، دو بار ساب کالچر انجام دهيد. ساب کالچر دوم همان کشت کاری (ژCulture working) مي باشد.
پليت ها را در دمای ۸-۲ درجه سانتیگراد( در مورد ارگانيسم های غير سخت رشد) يا شرايط مناسب برای هر نوع ميکروارگانيسم نگهداری نماييد.

توجه:

ويال ذخيره مورد استفاده، بعد از ذوب شدن بايد دور انداخته شود و نبايد مجدداً فريز گردد.
قبل از استفاده از سويه رشد يافته روی هر پليت بايد از خالص بودن سويه، اطمينان حاصل نمود.
از کشت ذخيره فريز شده حداکثر تا ۳ پاساژ پشت سر هم ميتوان انجام داد. پس از آن، پليت بايد دور انداخته شود و از يک کشت ذخيره فريز شده ديگر استفاده گردد. پاساژهای پشت سر هم مکرر (بيش از ۳ پاساژ)، احتمال تغيير فنوتيپي سويه ها را افزايش مي دهد.

۲- نگهداري در دماي اتاق با كشت در محيط BHIA

محيط کشت Brain Heart Infusion Agar (BHIA) را با شيب کم در لوله شيشه ای درپيچ دار تهيه نماييد. برای باکتری های سخت رشد، خون تازه يا خون حرارت داده شده، به محيط اضافه نماييد.
روغن معدني) يا پارافين مايع( را در اون استريل نماييد.
ميکروارگانيسم مورد نظر را روی سطح محيط کشت دهيد و در شرايط مناسب برای هر ميکروارگانيسم انکوبه نماييد.
بعد از اطمينان از وجود رشد کافي، روغن استريل را به مقدار یک میلی لیتر روی سطح محيط بريزيد، به گونه ای که سطح شيبدار محيط را بپوشاند.
لوله ها را با رعايت شرايط ايمني در دمای اتاق نگهداری کنيد.
در صورت نياز به کشت مجدد سويه، با لوپ استريل از قسمت زيرين روغن برداشته و روی محيط آگار خوندار يا شکلاته کشت دهيد.
از لوله ذخيره بعد از ۱۲-۶ ماه تجديد کشت نماييد.

۳- نگهداري در دماي اتاق با كشت در محيط TSA

اين روش فقط برای باکتری هايي که سخت رشد نيستند، مانند استافيلوکک و انتروباکترياسه به کار مي رود.

محيط کشت آگار بدون کربوهيدرات را با عمق زياد در لوله شيشه ای درپيچ دار تهيه کنيد. محيط Tryptic Soy Agar (TSA) پيشنهاد مي شود.
باکتری را به صورت کشت عمقي در اين محيط تلقيح کنيد.
محيط را به مدت ۲۴-۱۸ ساعت در دمای۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد انکوبه نماييد.
سپس لوله درپيچ دار را در پارافين مذاب فرو ببريد، که کاملا در لوله را بپوشاند.
لوله ها را با رعايت شرايط ايمني در دمای اتاق نگهداری کنيد. از لوله ذخيره بعد از ۱۲-۶ ماه تجديد کشت نماييد.

نگهداري کوتاه مدت (کمتر از یک سال):

۱- كشت در محيط CTA براي نيسريا و استرپتوكک

محيط کشت Cystine Tryptic agar (CTA) به اضافه یک میلی لیتر سرم استريل اسب را با عمق زياد در لوله شيشه ای درپيچ دار تهيه کنيد .
سويه نيسريا يا استرپتوکک را به طور عمقي در اين محيط کشت دهيد.
محيط را به مدت ۷۲-۲۴ ساعت در دمای ۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد و CO₂ پنج درصد انکوبه نمایید.
سپس لوله درپيچ دار را در پارافين مذاب فرو ببريد، که کاملا درِ لوله را بپوشاند.
برای نيسرياها لوله را در ۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری کنيد و هر دو هفته يکبار تجديد کشت نماييد. برای استرپتوکک ها لوله را با رعايت شرايط ايمني در دمای اتاق نگهداری کرده و هر ماه تجديد کشت کنيد.

۲- كشت در محيط Cooked Meat براي باكتري هاي بی هوازي

محيط Cooked Meat را در لوله های شيشه ای درپيچ دار تهيه کنيد.
باکتری را در اين محيط تلقيح کنيد. محيط را به مدت ۷۲-۲۴ ساعت در دمای ۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد انکوبه نماييد.
لوله ها را با رعايت شرايط ايمني در دمای اتاق نگهداری کنيد.
هر دو ماه يکبار تجديد کشت نماييد.

۳- کشت در (Tryptic Soy Agar) TSAبراي باكتري هاي با رشد سريع

باکتری مورد نظر را در سطح محيط TSA لوله ای درپيچ دار کشت دهيد.
محيط را به مدت ۲۴-۱۸ ساعت در دمای ۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد انکوبه نماييد.
پس از رشد کامل، لوله را در يخچال نگهداری کنيد.
هر ۴-۲ هفته يکبار تجديد کشت نماييد.

۴- کشت در Sheep blood Agar (آگار خوندار) برای استرپتوکوک ها

سويه مورد نظر را در سطح محيط آگار خوندار لوله ای درپيچ دار کشت دهيدد.
محيط را به مدت ۷۲-۲۴ ساعت در دمای ۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد انکوبه نماييد.
پس از رشد کامل، لوله را در يخچال نگهداری کنيد.
هر دو هفته يکبار تجديد کشت نماييد.

۵- کشت در Chocolate Agar (شکلات آگار) براي مننگوكک و هموفيلوس

سويه مورد نظر را در سطح محيط شکلات آگار لوله ای يا پليتي کشت دهيد.
لوله يا پليت را به مدت ۷۲-۲۴ ساعت در۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد انکوبه کنيد.
لوله يا پليت را بعد از رشد در حرارت اتاق نگهداری کنيد.
هر دو هفته يکبار تجديد کشت نماييد.

۶- کشت در Chocolate Agar برای گونوكک

سويه مورد نظر را در سطح محيط شکلات آگار پليتي يا شيبدار لوله ای کشت دهيد.
لوله يا پليت را به مدت ۷۲-۲۴ ساعت در ۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد انکوبه کنيد.
پس از اين مدت، لوله يا پليت را مجدداً در اين درجه حرارت ( ۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد) نگهداری نماييد.
هر دو روز يکبار تجديد کشت کنيد.

منابع برگزیده:

آزمایشگاه مرجع سلامت، بخش میکروب شناسی.

Quality Control for Commerically Prepared Microbiological Culture Media- Approved Standard, Third Edition; M22–A3, Vol. 24 No. 19, June 2004.
Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests- Approved Standard, Eleventh Edition; M02–A11, Vol. 32 No. 1, January 2012.
Clinical Microbiology Procedures Handbook, second edition update, Garcia, Lynne S. & Isenberg, Henry D., 2007 .
Basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology World Health Organization Geneva, 1991 .