تشخیص ۹۶ آلل HLA-A،HLA-B و HLA-DR به روش مولکولی
در حال حاضر دانش ما درباره سیستم HLA به طور چشمگیری پیشرفت کرده به طوری که تعیین خصوصیات HLA بوسیله آنالیز ژنتیکی امکان پذیر شده است. امروزه از روشهاي مولكولي مانند واكنش زنجيره اي پليمراز (PCR) براي شناسايي جايگاههاي ژني MHC استفاده مي شود. در روش PCR از قطعات اوليگونوكلئوتيدي (پرايمرهاي) اختصاصي انتهاي اگزونهاي رمزدهنده نواحي پلي مورف مولكولهاي MHC كلاس I و يا II براي تكثير و سپس آناليز اين نواحي استفاده مي نمايند. بنابراين بدين شكل مي توان توالي نوكلئوتيدي آلل هاي مختلف مولكولهاي MHC را به طور دقيق تر شناسايي نموده و در بررسي سازگاري بافتي در پيوند اعضا مورد استفاده قرار داد.
در روش HLA Typing با استفاده از SSP-PCR آزمایشات متعددی به طور همزمان بر روی یک نمونه انجام می شود. هر یک از این آزمایشات حضور یا عدم حضور یک پلی مورفیسم را با استفاده از پرایمرهای اختصاصی برای سکانس مربوط به هر آلل (SSP)، بررسی می کند. با استفاده از تکنیک PCR نسخه های متعددی از مناطق هدف و اختصاصی DNA در کروموزوم ۶ که حاوی توالی کد کننده آلل های HLA هستند را تولید می شود. این سیستم متکی به فقدان فعالیت اگزونوکلئازی ́۵ به ́۳ آنزیم DNA پلی مراز Taq می باشد که در واکنش PCR استفاده می شود. با استفاده از این آنزیم، تکثیر زما نی صورت می گیرد که این پرایمرها بتوانند به طور کامل و دقیق به سکانس های مربوط به آلل ها جفت شوند. به کار گیری پرایمرهای اختصاصی برای سکانس مربوط به آلل ها منجر به تشخیص مستقیم پلی مرفیسم آللی می شود.
برای انجام HLA Typing به روش SSP انجام دادن واکنش های متعدد به طور همزمان امری ضروری است. برای نمونه حداقل ۹۶ واکنش به منظور تعیین آلل های HLA-A, B, DRB1 وجود دارد. همچنین کنترل هایی برای جلوگیری از خطای تکثیر و نتایج منفی کاذب وجود دارد که این پرایمرها در هر واکنش ژن های بسیارحفاظت شده ( اغلب هورمون رشد انسانی) را تکثیر می دهند. محصول این پرایمرهای کنترل داخلی به سادگی با استفاده از الکتروفورز روی ژل آگاروز و سپس رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید و در نهایت مشاهده آن توسط نور UV تشخیص داده می شود. اگر توالی مکمل برای پرایمر به کار رفته وجود نداشته باشد هیچ گونه تکثیری صورت نمی گیرد و هنگام بررسی ژل، باندی مشاهده نمی شود. در نهایت نتایج با مقایسه اشکال واکنش به صورت دستی یا با استفاده از نرم افزار کامپیوتری که برای هر تست به طور اختصاصی طراحی شده است، تفسیر می گردد.
این روش سریع ترین سیستم برای بدست آوردن HLA Typing کامل با استفاده از روش های مولکولی است که به طور وسیعی در هر لحظه در دسترس می باشد. به طوری که از پذیرش نمونه تا تفسیر تصویر ژل با روشهای براساس DNA تقریبا ۳٫۵ ساعت به طولمی انجامد. در آینده ممکن است این روش با روشهای Real time PCR جایگزین شود که نیاز به آنالیز محصولات با استفاده از ژل را مرتفع می سازند. اما هنوز PCR-SSP به عنوان سریعترین روش بر اساس DNA، در اکثر مراکزی که HLA Typing انجام می دهند، می باشد.
منابع برگزیده:
- DNA METHODS FOR HLA TYPING A WORKBOOK FOR BEGINNERS
- Abbas A, Lichtman A: cellular and molecular Immunology, fifth edition, 2003
- en.wikipedia.org
عزيزاني که ساکن اهواز هستند ميتوانند از آزمايشگاه پاستور اهواز با بهترين امکانات و تکنولوژي روز، جهت هر نوع آزمايشي استفاده نمايند.
با تشکر مديريت سايت آزمايشگاه اهواز – پاستور
