بیماریهای انگلی
بخش تشخیص مولکولی
یکی از روشهای تکثیر DNA استفاده از روشPCR می باشد. این روش بدلیل کاربردها و مزیت های بسیار زیاد آن به سرعت در آزمایشگاه های مولکولی گسترش پیدا کرد و هم اکنون این روش در این آزمایشگاه ها جزو کارهای متداول می باشد.
واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR )
در سال ۱۹۸۳ کاری مولیس، روشی موسوم به واکنش زنجیره ای پلیمراز را برای تکثیر ترادف های خاصی از DNA ابداع نمود. PCR از نظر اصول عملی تشابه زیادی به همانندسازی DNA دارد و در واقع بر گرفته از آن می باشد. تکنیک PCR شامل سیکل های تکرارشونده ای است که در آن با گرم و سرد شدن DNA به کمک پرایمرها، آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت در شرایط بافری مناسب و یون ⁺Mg² و در حضور چهار باز سازنده dNTPs) DNA) از روی DNA الگو عمل همانندسازی انجام می دهد. فرایند تکثیر DNA با این روش به صورت تصاعدی است و بنابراین می توان مقادیر زیاد DNA بدست آورد. پرایمرها مکمل بخش هایی از دو رشته DNA هستند و ناحیه ای که باید تکثیر شود را تعیین می نمایند.
امروزه روش PCR جایگاه بسیار مهمی را در شناسایی و جداسازی ژن ها، کلونینگ، بیولوژی مولکولی،
میکروب شناسی تشخیصی، تشخیص سرطان و بیماری های ژنتیک، تشخیص هویت، جرم شناسی، تعیین ترادف، باستان شناسی، مطالعه تکاملی موجودات پیدا نموده است.
مراحل PCR
• مرحله شروع (Initialization step): این مرحله فقط برای DNA پلیمرازهایی که نیازمند فعال شدن توسط حرارت در روش hot-start PCR هستند، ضروری است.در این مرحله دمای محلول واکنش به مدت معینی به ۹۴ تا ۹۶ درجه می رسد.
• مرحله واسرشت (Denaturation step): در این مرحله بعلت گسستن پیوندهای هیدروژنی بین نوکلئوتیدها دو رشته DNAی الگو از هم جدا می شوند و تک رشته های DNA حاصل می گردد. این مرحله اولین قسمت از سیکل های حرارتی است و شامل حرارت دادن محلول واکنش به مدت معین در دمای ۹۴ تا ۹۶ درجه است.
• مرحله اتصال (Annealing step): در این مرحله دمای واکنش به ۵۰ تا ۶۵ درجه کاهش می یابد و پرایمرها که مشابه دو طرف قطعه DNA مورد نظر برای تکثیر طراحی و ساخته شده اند به توالی های مکمل خود در دو رشته باز شده DNA متصل می گردند. این دو قطعه انتهای ΄۳ آزاد جهت فعالیت آنزیم DNA پلیمراز را فراهم می کند.
• مرحله طویل شدن (Extension/elongation step): دمای محلول در این مرحله متناسب با نوع DNA پلیمراز مورد استفاده است. دمای اپتیمم برای آنزیم Taq polymerase حدود ۷۵ الی ۸۰ درجه است که معمولا دمای ۷۲ درجه انتخاب می شود. در این مرحله آنزیم DNA پلیمراز با استفاده از چهار باز سازنده DNA موجود در محلول، یک رشته DNAی جدید را در جهت َ۵ به َ۳ و در مقابل رشته های الگو می سازد. مدت زمان این مرحله نیز باید متناسب با نوع DNA پلیمراز و طول رشته DNA باشد. در این مرحله شدن در صورت وجود سوبسترای کافی و تامین شرایط بهینه، مقدار DNA در محلول PCR دو برابر می شود. بنابراین در هر سیکل PCR، غلظت DNA بصورت تصاعدی افزایش می یابد.
• مرحله طویل شدن نهایی (Final elongation): این مرحله، پس از آخرین سیکل PCR، به مدت زمان معین در دمای ۷۰ الی ۷۴ درجه انجام می شود، تا اطمینان حاصل شود که همه تک رشته های DNA همانند سازی شده اند.
• نگهداری نهایی (Final hold): در این مرحله، محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای ۴ الی ۱۵ درجه قابل نگهداری است.
چرخه دمایی و تکثیر ژن هدف در آزمایش PCR
• الکتروفورز در ژل آگارز: سرانجام می توان محصولات PCR را بر روی ژل آگارز و همراه با مارکر وزن مولکولی(DNA ladder که حاوی قطعات DNA با اندازه های مشخص است) الکتروفورز نمود، و نتایج PCR را بررسی نمود.
مراحل انجام الکتروفورز
واکنش RT-PCR
RNA به اشکال mRNA و rRNA به میزان زیادی در سلولهای یوکاریوتی جانوری، گیاهی، قارچی و همچنین در باکتریها وجود دارد. در تکنیک RT-PCR به دلیل اینکه از RNA به عنوان الگو برای تکثیر استفاده می شود لذا طی مرحله ای RNA باید به cDNA تبدیل شود. RNA استخراج شده با استفاده از آنزیم نسخه بردار معکوس به cDNA تبدیل می شود. سپس cDNA ساخته شده توسط تکنیک PCR تکثیر می یابد.
Real time PCR
روش PCR، تکنیکی با حساسیت و اختصاصیت بالا برای شناسایی اسیدهاي نوکلئیک می باشد که راه اندازي و استفاده از آن به خوبی انجام می گردد ولی تعیین کمیت اسیدهاي نوکلئیک اختصاصی موجود در نمونه، کار آسانی نیست و تغییراتی که ممکن است طی آماده سازي، نگهداري و یا انجام واکنش صورت گیرد، تعیین دقیق مقدار اسیدهاي نوکلئیک اختصاصی را مشکل می سازد. سرعت در انجام آزمایش، حذف مرحله وقت گیر بعد از تکثیر مانند الکتروفورز ژل یا Southern blotting، مشاهده لحظه به لحظه واکنش و خاتمه دادن به آن در هر زمان، حساسیت و اختصاصیت بالا و انجام واکنش کمی و بدست آوردن مقدار دقیق ژنوم در روش Real time PCR موجب تحول بزرگی در زمینه های مختلف علوم شده است.
اولین بار ایده این روش توسط هیگاشی و همکارانش ارائه شد که به مفهوم مشاهده لحظه به لحظه واکنش بر اساس میزان فلورسانس ساطع شده از واکنش و مشاهده و ثبت آن در یک شناساگر می باشد. در این روش از یک پروب نشاندار استفاده می شود که قابلیت اتصال اختصاصی به ژنوم هدف را دارا می باشد. در حال حاضر این روش ها به دو صورت در کیت های تشخیصی استفاده می شود. در روش اول پروب نشاندار پس از تکثیر به محصول اضافه می گردد و در طی روند هیبریداسیون به محصول متصل می شود این روش که از حساسیت بسیار بالایی برخوردار است اساس Micro array را تشکیل می دهد و برای تعیین ژنوتایپ به کار می رود. در روش دوم پروب نشاندار در واکنش حضور داشته و در طی تکثیر تجزیه شده و نور ساطع می کند که در هر سیکل قابل اندازه گیری می باشد این روش Real time PCR نام دارد.
روش های رایج نشانه گذاری در Real time PCR
روش های نشانه گذاری که در Real time PCR استفاده می شود را می توان به دو دسته تقسیم و مورد استفاده قرار داد.
۱- استفاده از رنگ های متصل شونده بر DNA
Syber green Ι متداول ترین رنگی است که در سیستم هاي تشخیصی غیر اختصاصی (nonspecific detection system) در مطالعات بیولوژیک به کار می رود اما اخیرا رنگ هاي دیگر نظیر Amplifour نیز مورد استفاده قرار گرفته است. سایبرگرین یک رنگ فلورسانت است که بصورت محلول و متصل نشده دارای خاصیت فلورسانس کمی می باشد اما با اتصال درشکاف کوچک (DNA Minor Groove) DNA در مرحله Annealing وتکثیر DNA، همزمان با افزایش دو رشته ای شدن DNA نور فلورسانس بیشتری ساطع می کند. اساس روش Real-Time نورسنجی است بدین صورت که میزان نور فلورسانس ساطع شده در هر سیکل توسط دستگاه خوانده
می شود. میزان نور فلورسانس ساطع شده نمایانگر میزان نمونه اولیه خواهد بود و با میزان محصولات PCR نسبت مستقیمی دارد. هنگامی که DNA در سیکل های متوالی، تکثیر می شود، رنگ به محصولات تکثیر شده متصل شده و شدت فلورسانس محلول در ۵۲۰ نانومتر افزایش می یابد. سیگنال فلورسانس در فاز extension افزایش می یابد، به عبارتی حداکثر فلورسانس در پایان مرحله extension و حداقل آن در مرحله denaturation است. فلورسانس ساطع شده توسط دستگاه، قابل شناسایی و اندازه گیري می باشد.
اساس روش سایبرگرین
این روش بسیار آسان و مقرون به صرفه است و نیاز به طراحی پروب اختصاصی و مشکلات مربوط به آن را ندارد. البته از آنجایی که سایبرگرین فاقد اختصاصیت براي توالی خاصی است و به تنهایی قادر به تمایز بین DNA دورشته اي موجود در محلول و محصولات غیر اختصاصی و دایمرهاي پرایمر نمی باشد باید منحنیMelting Curve Analysis با توجه به نمودار ذوب برای هر نمودار رسم کرد. بدین ترتیب پس از پایان PCR دستگاه دمای محصولات PCR را به ۹۴ درجه افزایش می دهد در این دما همه DNA ها تک رشته شده، سپس به طور منظم دما کاهش یافته و با دو رشته ای شدن DNA و جایگزینی و اتصال سایبرگرین و افزایش ناگهانی میزان فلورسانس ساطع شده، منحنی ذوب رسم می شود که با آنالیز منحنی ذوب می توان تمایز بین باندهای غیر اختصاصی، اختصاصی و پرایمر دایمر را مشاهده نمود. محصولات PCR با سکانس یا طول متفاوت، در دماهاي متفاوتی ذوب شده و پیک مشخصی می دهند. اگر در واکنش، فقط محصول اختصاصی PCR باشد، تنها یک پیک قابل رؤیت است.
به عبارت دیگر، در این روش دستگاه درجه حرارت نمونه ها را به آهستگی افزایش داده و به طور مداوم شدت فلورسانس هر نمونه را از درجه حرارت کمتر از نقطه ذوب محصول تا درجه حرارت بالاتر از نقطه ذوب محصول (که کاربر محدوده آنرا مشخص می کند) ثبت می کند. محصولات بر اساس طول و میزان GC موجود در رشته در دماهاي متفاوت ذوب می شوند. ذوب شدن هر محصول با کاهش ناگهانی در شدت فلورسانس نمونه که توسط دستگاه اندازه گیري می شود، مشخص می گردد. با بررسی تفاوت در منحنی هاي ذوب، نقاط ذوب براي هر محصول تکثیر شده مشخص می شود. بدین ترتیب می توان مقادیر کمی واقعی محصول مورد نظر را در پایان واکنش بدست آورد.
آنالیز نمودار دماي ذوب
۲- استفاده از پروب
با استفاده از این پروب ها میزان حساسیت و اختصاصیت افزایش یافته است. در این پروب ها یک رنگ فلورسانس به نام Reporter در ΄ ۵ و رنگ فلورسانس دیگری در ΄۳ به نام Quencher تعبیه می شود هنگامی که Reporter و Quencher در فاصله نزدیکی از هم قرار دارند (در حالت معمول پروب) اگر نوری ساطع شود توسط Quencher جذب شده و ثبت نمی گردد ولی به محض جدا شدن این دو رنگ (در اثر تکثیر و شکسته شدن پروب) نور ساطع شده به وسیله Reporter توسط Quencher قابل جذب نیست و توسط دستگاه به صورت فلورسانس قابل اندازه گیری می باشد.
رنگ هایی که در Real time PCR استفاده می شوند
پروب Taq Man: آنزیم Taq Polymerase با استفاده از خاصیت فعالیت ΄ ۵ اگزونوکلئازی در حین تکثیر الگو پروب را تجزیه کرده ، سپس Reporter از Quencher جدا شده و فلورسانس ساطع می شود.
پروب Taq Man
پروب Beacon:
این پروب ساختار لوپی شکل دارد و دارای رنگ هایی در انتهای ΄۳ و ΄۵ می باشد ولی بر خلاف Taq Man تجزیه نمی شود و در سیکل های بعدی مورد استفاده قرار می گیرد.
پروب Beacon
۳- Hybridization Probes
در این سیستم که Fret (Fluorescence resonance energy transfer) نامیده می شود پروب به شکل دو قطعه مختلف طراحی شده و رنگ های فلورسانس یکی در انتهای ΄۳ و دیگری در انتهای΄۵ قرار می گیرند سپس هنگامی که این دو رنگ پس از چسبیدن پروب در کنار هم قرار می گیرند فلورسانس ساطع شده و توسط دستگاه اندازه گیری می شود.
روش های انجام Real Time PCR
اندازه گیري میزان محصول توالی هدف به دو روش انجام می پذیرد:
اندازه گیري مطلق (Absolute Quantification)
در این روش به طور معمول تعداد توالی هدف موجود در یک نمونه با استفاده از سیگنال Real Time PCR نسبت به منحنی استاندارد محاسبه می شود. منحنی استاندارد را می توان براساس استانداردهایی که مقدار آن ها مشخص است ترسیم نمود. از این روش بدون رسم منحنی استاندارد و محاسبه تعداد کپی در تشخیص کیفی در کیت های تشخیصی استفاده می شود.
اندازه گیري نسبی (Relative Quantification)
در اندازه گیري نسبی میزان بیان ژن مورد نظر را نسبت به ژنهاي ساختاري سلول تحت عنوان House Keeping Gene بیان می کنند. از جمله ژنهاي ساختاري سلول می توان به β-Actin و GAPDH اشاره کرد. این روش بیشتر در ارزیابی بیان ژن به همراه روش Absolute Quantification کاربرد دارد.
امروزه با پیشرفت هاي بسیاري که انجام شده است این تکنیک به عنوان یک روش دقیق و حساس جهت تعیین کمیت DNA و RNA به کار می رود. در این تکنیک، محصولات PCR طی فاز تصاعدي (Exponential phase) پروسه تکثیريPCR ، اندازه گیري می گردد. سیگنال فلورسنت درطی هر سیکل PCR و یا بعد از آن قابل شناسایی بوده و یافته هاي آن در مدت زمان کوتاهی بدست می آید. همچنین به دلیل اینکه درب لوله هاي واکنش باز نمی شود؛ خطر آلودگی محصولات PCR خیلی کم است. اندازه گیري مجموع محصولات در Real Time PCR توانایی واکنش را تعیین می کند بنابراین انتخاب ارزیابی حساس تر را ممکن می سازد. در حال حاضر ابزار متعددي براي Real Time PCR در دسترس می باشد که مجموع محصولات را با استفاده از فلورسنت در هر سیکل اندازه گیري می کنند. فلورسنت اندازه گیري شده متناسب با سیکل نمایانگر تکثیر(amplification) می باشد .
در حقیقت بهترین فاز تکثیر که داده هاي مفید و قابل تکرار از آن بدست می آید، فاز ثابت است. در این فاز از چرخه تکثیر ارتباط دقیقی بین مقدار DNA اولیه و محصول تکثیر شده وجود دارد. Real Time PCR بهترین راه حل براي مشخص کردن مقدار محصول تولید شده در این فاز است. دستگاه هاي Real Time PCR امروزي، متشکل از ترموسایکلر و فلورومتر هستند که میزان فلورسانس را در هر چرخه اندازه گیري می کند. رایانه متصل به دستگاه، داده ها را جمع آوري کرده و در قالب نمودار گرافیکی نمایش می دهد. تصویرداده هاي میزان فلورسانس، حداقل یک نوبت در هر چرخه تکثیر ثبت می شوند. کاربر قادر است تا میزان تکثیر هر نمونه را در هر چرخه کنترل کرده و میزان تکثیر را در مقایسه با استانداردها، کنترل مثبت و کنترل منفی مشاهده کند.
نمودار لگاریتمی تکثیر در آزمایشReal Time PCR
علاوه بر این کاربر قادر به کنترل کردن همه واکنش ها در طی پروسه تکثیر است ومی تواند بر اساس نتایج بدست آمده طی چرخه ها، اقدام به بهینه کردن دستورات دستگاه نماید که منجر به افزایش حساسیت، اختصاصیت و بازده خواهد شد. پس از جمع آوري داده هاي اولیه، مرحله آنالیز آغاز می شود. نرم افزار دستگاه داده ها را بر اساس تفاوت آنها با فلورسانس زمینه، نرمالایزه می کند. هنگامی که نرمالایزه کردن انجام شد، می توان خط آستانه را مشخص کرد. خط آستانه خطی است که بر مبناي آن داده ها آنالیز خواهد شد. تعداد چرخه ها تا رسیدن منحنی نمونه به خط آستانه، CT نام دارد. خط آستانه طوري انتخاب می شود که میزان تکثیر DNA در فاز ثابت، حداکثر مقدار باشد تا دقیق ترین و قابل تکرارترین نتایج بدست آید.
نمودار خطی تکثیر در آزمایشReal Time PCR
سیکلی که در آن منحنی Real time PCR خط Threshold را قطع می کند CT نامیده می شود و از این سیکل به بعد تکثیر وارد فاز لگاریتمی شده و به فازهای Exponential و در نهایت به فاز اشباع Plateau می رسد.
در صورتی که نمونه هاي استاندارد با غلظتهاي مشخص، موجود باشد، به روش آنالیز رگرسیون خطی، منحنی استاندارد رسم می شود و به کمک آن غلظت نمونه هاي مجهول محاسبه می شود.
دستگاه های ترموسایکلر مورد استفاده در بخش تشخیص مولکولی
دستگاه مربوط به آزمایش Real Time PCR (Quantitative PCR)
دستگاه مربوط به آزمایش PCR کیفی یا Conventional (Qualitative PCR)
Leishmania
Toxoplasma gondii
