تکی : Post

بخش میکروب شناسی

میکروب‌شناسی علمی است که در درباره شکل، ساختمان، متابولیسم و کلیه ویژگی های موجودات زنده ذره بینی بحث می کند و رابطه این موجودات را با بعضی بیماریهای انسان، جانوران و گیاهان مورد بررسی قرار می دهد.

بخش میکروب شناسی آزمایشگاه پاستور به صورت مجزا از سایر بخش ها و مجهز به تجهیزات مدرن و اختصاصی می باشد. این بخش دارای قسمت نمونه برداری می باشد که با رعایت شرایط استریل نمونه برداری از زخم و ضایعات پوستی و نیز نمونه برداری از چشم، گوش، بینی، گلو و سایر نقاط بدن انجام می گردد. همچنین این بخش دارای قسمتهای مجزای کشت میکروبی، محیط سازی، انکوباسیون و استریلیزاسیون می باشد. در این بخش به طور معمول جهت جستجوی عامل بیماریزا کشت کلیه مایعات وترشحات بدن درشرایط استریل در محیطهای کشت میکروبی و همچنین رنگ آمیزی ها و آزمایشات مستقیم باکتری شناسی انجام می گردد. متعاقب شناسایی عوامل بیماریزا آزمایش آنتی بیوگرام انجام شده و حساسیت عوامل بیماریزا نسبت به آنتی بیوتیک های مختلف بررسی می شود.

همانند سایر بخش‌های آزمایشگاه پاستور بخش میكروب شناسی نیز دارای برنامه‌ی كنترل كیفی براساس الزامات مرجع سلامت و سایر استانداردهای آزمایشگاهی معتبر می باشد كه روزانه توسط مسوول بخش میكروب شناسی ومسوول كنترل كیفی آزمایشگاه اجرا و نظارت می‌گردد.

انجام کنترل کیفی دقیق روزانه همراه با داشتن تخصص و تجربه کافی کارکنان این بخش، همچنین استفاده از مواد اولیه مرغوب و معتبر در کنار بهره مندی از امکانات ویژه کشت و جداسازی انواع نمونه های میکروبی، تشخیص صحیح، به موقع و موثر بیماری های عفونی را فراهم نموده است و آزمایشگاه پاستور را به عنوان بهترین ارائه دهنده خدمات تشخیصی در زمینه میکروب شناسی در خوزستان معرفی نموده است.

آزمایش های قابل انجام در بخش میکروب شناسی

• Urine culture & Sensitivity
• Stool (C+S)
• throat (C+S)
• Throat Smear (gram stain)
• Sputum (C+S)
• Sputum Smear (gram Stain)
• Sputum AFB Direct Smear
• Urethral (C+S)
• Urethral Smear (gram Stain)
• Vaginal Wet Prep (Direct smear)
• Vaginal discharge (C+S)
• Wound Direct smear
• Wound (Skin) (C+S)
• Wound AFB
• Breast discharge Direct smear
• Breast discharge (C+S)
• Eardischarge Direct smear
• Ear discharge (C+S)
• Nasal discharge (C+S)
• Nasal discharge Direct smear
• Eye discharge Direct smear
• Eye (C+S)
• Semen (C+S)
• Blood (C+S)
• S.F Direct smear
• S.F AFB
• S.F (C+S)
• Ascitic fluid (C+S)
• Ascitic Direct smear
• Ascitic AFB
• Pleural (C+S)
• Pleural Direct smear
• Pleural AFB
• Synovial Direct smear
• Synovial C+S
• F.B (morning urine)
• Bronchoalveolar Lavage (BAL) AFB
• Gastric Lavage AFB
• Abscess drain Culture
• Peritoneal (C+S)
• Synovial fluid AFB
• Pulmonary discharge
• Pericardial fluid (C+S)
• Pericardial fluid AFB
• Smear for Diphtheria
• Semen (Culture)
• Vaginal discharge (Culture)
• Stomach Lavage for BK

کشت ادرار

این آزمایش برای تشخیص عفونت مجرای ادراری در مبتلایان به دیزوری، تکرار و اضطرار در دفع ادرار مورد استفاده قرار می گیرد. در زنان و مردان عفونت مجرای ادراری ممکن است بدون علامت، حاد و یا مزمن باشد. عامل عفونت در بیشتر موارد باسیل های روده ای به ویژه E.coli، گونه های پروتئوس و انتروکوک ها می باشد. در ده درصد عفونت ها ممکن است دو باکتری عامل عفونت باشند. وجود بیش از سه نوع باکتری در کشت نشانگر عدم جمع آوری صحیح نمونه و آلودگی است.

نمونه گیری

• برای انجام کشت ادرار نمونه ادرار صبحگاهی بهتر است.
• نمونه ادرار باید در ظرف دهانه گشاد استریل جمع آوری شود.
• قبل از انجام نمونه گیری منفذ ادراری باید با آب و صابون شسته شود و بعد از آبکشی قسمت اول ادرار دور ریخته شود و قسمت میانی ادرار در ظرف مخصوص جمع آوری گردد.
• نمونه ادرار در عرض دو ساعت باید کشت داده شود. در صورت عدم امکان کشت نمونه می تواند تا ۱۸ ساعت در یخچال نگهداری شود.
• در صورتی که نمونه ادرار در منزل تهیه شود باید سریع (ظرف ۳۰ دقیقه) به آزمایشگاه منتقل شود.
• آلودگی نمونه با مدفوع، ترشحات واژن، دست ها یا البسه موجب نتایج مثبت کاذب می شود.
• مصرف آنتی بیوتیک بر نتیجه آزمایش تاثیر می گذارد.

روش انجام:

• از لوپ کالیبره شده برای کشت ادرار استفاده می شود.
• لوپ را به طور عمودی در ظرف ادرار فرو برده و به صورت یک خط در وسط محیط بلاد آگار و مکانکی کشت داده و سپس آن را پخش نمایید. پس از کشت ادرار محیط‌ها را به مدت ۲۴ ساعت انکوبه کنید.
• سپس کلنی‌های ظاهر شده برروی هر کدام از پلیت‌ها را شمارش و در ضریب حجم لوپ ضرب نمایید.
• کشت ها را پس از ۲۴ ساعت بررسی کنید در صورتی که رشد واضحی دیده نمی شود و یا رشد برای شناسایی خیلی جوان است به مدت ۲۴ ساعت دیگر انکوبه نمایید.
• در صورتی که تعداد لکوسیت های ادرار بیش از سه عدد در هر میدان میکروسکوپی با بزرگ نمایی ۴۰۰ باشد کلونی ها به هر تعدادی که باشد باید تعیین هویت و آنتی بیوگرام انجام شود.
• در ادرار خانم ها و آقایان با تعداد کلونی بین ۱۰ تا ۱۰۰ هزار آزمایش باید تکرار گردد و در صورتی که تعداد کلونی دوباره به همین صورت بود، آنتی بیوگرام انجام شود.
• در آقایان تعداد ۱۰۰ هزار کلونی حتی در صورت پایین بودن تعداد لکوسیت آنتی بیوگرام شوند و در خانم ها پس از تکرار آزمایش آنتی بیوگرام انجام شود.
• اگر کشت ادرار مثبت بوده اما نمونه فاقد لکوسیت باشد در این صورت کشت فاقد اعتبار می‌باشد. (احتمال آلودگی با مدفوع).
• در صورتی که نمونه ادرار با سرنگ بطور مستقیم از مثانه آسپیره شده باشد، تعداد کلونی ها هر چه باشد آنتی بیوگرام انجام شود.

کشت مدفوع

کشت مدفوع برای بیماران دچار اسهال شدید، تب و نفخ شکمی درخواست می شود. به طور طبیعی مدفوع حاوی باکتری و قارچ زیادی می باشد. ولی باکتری های نظیر سالمونلا، شیگلا، کمپیلوباکتر، یرسینیا، اشریشیاکلی و استافیلوکوک پاتوژن برای روده بیماریزا هستند.

نمونه گیری:

• در هنگام نمونه گیری و انتقال مدفوع از دستکش استفاده نمایید.
• برای جمع آوری نمونه از ظرف مناسب استفاده کنید.
• نمونه ی مدفوع را بلافاصله به آزمایشگاه انتقال دهید.
• ادرار می تواند مانع از رشد باکتری ها شود. به همین دلیل نباید نمونه مدفوع با ادرار مخلوط شود.

روش انجام:

• حداکثر ۲ ساعت پس از دریافت نمونه مدفوع توسط آزمایشگاه، نمونه باید مورد آزمایش و کشت قرار گیرد.
• در صورت ماندن بیش از حد نمونه و سرد شدن آن PH کاهش یافته و در نتیجه مانع از رشد بسیاری از انواع شیگلا و سالمونلا در محیط کشت می شود.
• هنگامی که نمی توان نمونه مدفوع را سریع مورد بررسی و آزمایش قرار داد آن را باید به محیط ترانسپورت انتقال داد.
• برای جداسازی باکتری های بیماریزای روده ای از محیط های انتخابی و افتراقی مناسب استفاده شود.
• بعد از انکوباسیون میزان رشد، رنگ و شکل کلونی ها بررسی و ثبت گردد.

کشت خون

هنگامی که سرعت تکثیر باکتری ها به حدی برسد که سیستم رتیکولواندوتلیال نتواند آن ها را از بدن حذف کند باکتریمی ایجاد می شود. با کتری ها به طور عمده از مناطق خارج عروقی و از طریق عروق لنفاتیک وارد خون می شوند. به طور طبیعی ماکروفاژهای ثابت کبد و طحال بعد از چند دقیقه تا چند ساعت باکتری ها را از جریان خون حذف می کنند و لی گاهی تعداد باکتری ها از حد توانایی سیستم فراتر می رود و سپتی سمی رخ می دهد. کشت خون می تواند در درمان این عفونت های کشنده کمک کننده باشد.

نمونه گیری:

• خونگیری از بیمار حتی المقدور قبل از تجویز داروهای آنتی بیوتیک انجام گیرد و بهترین زمان خونگیری زمانی است که بیمار علائم تب و لرز را نشان می دهد.
• بهتر است ۲ تا ۳ نمونه خون به فاصله یک ساعت از بیمار گرفته و کشت داده شود .
• محیط های کشت خون تهیه شده باید بلافاصله به آزمایشگاه منتقل شده و در انکوباتور ( ۳۷ درجه ) قرار داده شود.
• ضدعفونی کردن محل خونگیری، رعایت کامل شرایط استریل در موقع خون گیری ، تلقیح مستقیم خون به داخل بطری کشت خون ، می تواند تا حد زیادی از آلوده شدن کشت های خون جلوگیری نماید . هر چند با رعایت اینن موازین و در بهترین شرایط کاری ، حدود ۳ تا ۵ درصد کشت های خون در معرض آلودگی قرار می گیرند کهه این آلودگی می تواند منشا پوستی یا محیطی داشته باشد.

روش انجام:

• محیط کشت خون بصورت مایع و در ویال های شیشه ای پلمپ شده موجود می باشد. این محیط کشت حاوی ضد انعقاد (سدیم پلی آنتول سولفونات) جهت جلوگیری از لخته شدن می باشد.
• برای انجام کشت ابتدا باید درپوش بطری‌های کشت خون را قبل از ترزیق خون ضد عفونی کرد. سپس خون را به درون بطری تزریق کرده و بطری‌های کشت خون را به مدت ۴۸ ساعت در ۳۷ درجه قرار داد.
• بطری کشت خون باید به طور مرتب بررسی شود. کشت استریل معمولا به صورت لایه‌ای از گلبولهای قرمز که به وسیله محیط کشت شفاف پوشانده شده است مشخص می‌گردد.
• علائم رشد میکروب در محیط کشت خون به شرح زیر است:
• رسوب فولیکولار در سطح گلبولهای قرمزکدورت یکنواخت یا کدورتی که در زیر سطح مایع کشت خون دیده می‌شود.همولیزانعقاد محیط کشتایجاد پوسته نازک در سطحتولید گازدانه‌های سفید در سطح یا عمق گلبولهای قرمز
• هرگاه رشد باکتری در بطری مشهود باشد باید بوسیله سرنگ از بطری آسپیره نموده و رنگ آمیزی گرم و پاساژ بر روی محیط های مناسب انجام پذیرد.
• در موارد عادی کشت خون را تا ۷ روز نگهداری می‌کنند اما در موارد مشکوک به بروسلوز یا سایر میکروب‌های سخت رشد، اندو کاردیت و یا مصرف آنتی بیوتیک محیط کشت را باید بیشتر نگهداری نمود (۳ هفته) پس از مدت زمان فوق محیط‌های کشت را از نظر رشد کلنی‌ها مورد بررسی قرار می‌دهیم.
• بعضی باکتری ها بدون ایجاد کدورت رشد می کنند لذا پس از ۲۴ ساعت و بعد از ۷ روز حتی بدون دیدن کدورت هم ساب کالچر انجام می شود.
• از آنجایی که گزارش سریع نتیجه کشت خون می‌تواند سر نوشت ساز باشد لذا هر نتیجه‌ای را در هر مرحله باید بلافاصله به اطلاع پزشک معالج رساند.

کشت خلط

کشت خلط برای تعیین وجود باکتری بیماری زا در مبتلایان به عفونت های تنفسی مانند پنومونی انجام می شود.

نمونه گیری:

1. بهترین نمونه برای انجام آزمایش نمونه صبحگاهی است.
2. نمونه خلط برای انجام کشت باید قبل از شروع درمان ضد میکروبی جمع آوری شود.
3. نمونه تهیه شده را در ظرف مخصوص دهان گشاد ریخته و در دمای یخچال نگهداری شود و در اسرع وقت به آزمایشگاه ارسال گردد. ماندن بیش از حد نمونه خلط در خارج از آزمایشگاه در جواب آزمایش تاثیر می گذارد.
4. در تمام مراحل گرفتن نمونه باید از دستکش یکبار مصرف استفاده شود.

روش انجام:

• رنگ آمیزی گرم اولین مرحله آنالیز میکروب شناسی خلط می باشد. با رنگ آمیزی گرم باکتری ها به دو گروه گرم مثبت و منفی تقسیم می شوند.این روش ممکن است تا زمان کامل شدن آزمایش کشت برای تعیین درمان دارویی استفاده شود.
• پس از کشت نمونه خلط روی محیط های مناسب و طی زمان انکوباسیون، آنتی بیوگرام به منظور شناسایی مناسب ترین درمان دارویی ضد میکروبی انجام می شود.
• تکمیل آزمایش کشت حداقل به ۴۸ ساعت وقت نیاز دارد. ممکن است کشت خلط از نظر قارچ و مایکو باکتریوم توبرکلوزیس ۱۰-۶ هفته به طول انجامد.

کشت زخم

کشت زخم برای تشخیص وجود عوامل بیماریزا در بیماران مشکوک به عفونت زخم انجام می شود. عفونت های زخم اغلب بوسیله ارگانیسم های چرکزا بوجود می آیند، که ممکن است باکتریایی، قارچی یا انگلی باشند.

نمونه گیری:

• قبل از نمونه برداری کلیه وسایل لازم را آماده نمایید. وسایل باید استریل یا یکبار مصرف باشند.
• همه کشت ها را باید قبل از شروع درمان آنتی بیوتیکی انجام داد.
• جهت نمونه گیری زخم های سطحی سطح خارجی نمونه را با پنبه و الکل ۷۰% درصد تمیز کرده، چرک را از زخم آسپیره نموده یا با برش آن را جدا نمایید. سپس نمونه را به لوله درپوش دار استریل انتقال دهید.
• جهت نمونه گیری با سواپ، ابتدا یک سواپ پنبه ای استریل را به صورت آسپتیک وارد زخم نمایید. سپس سواپ را در یک لوله آزمایش درپوش دار استریل قرار دهید.( کشت نمونه از لبه های پوست در مقایسه با کشت ترشحات چرکی از دقت کمتری برخوردار است).
• در مورد نمونه گیری از بافت های نرم و زخم های عمیق باید سطح زخم را با الکل ۷۰% و سپس با تنتورید ۲% ضدعفونی نمود. سپس با آسپیراسیون از عمیق ترین قسمت ضایعه یا با عبور سواب به عمق ضایعه و یا از لبه ضایعه نمونه برداری را انجام داده و سپس نمونه را به لوله درپوش دار استریل انتقال دهید.
• در صورت مشکوک بودن به وجود ارگانیسمی بی هوازی، یک لوله کشت بی هوازی نیز در نظر گرفته شود. بهترین روش نمونه گیری، آسپیراسیون از زخم بسته و انتقال مستقیم چرک به درون لوله کشت بی هوازی میی باشد.
• اگر کشت زخم باید از بیماری گرفته شود که نیاز به شستشوی زخم دارد، نمونه گیری را قبل از شستن زخم انجام دهید.
• اگر قبل از انجام نمونه گیری جهت کشت، پماد یا محلول آنتی بیوتیک روی زخم مالیده شده است آن را با آب یا سالین استریل از روی زخم پاک نمایید.
• همه نمونه ها را به دقت حمل کنید. این نمونه ها ممکن است قادر به انتقال بیماری باشند.
• نمونه را بلافاصله به آزمایشگاه انتقال دهید.
• توجه شود اگر چرک در زخم یا بافت نرم مشاهده شد، بلافاصله باید بیمار تحت احتیاط های ایزوله نمودن پوست و زخم قرار گیرد. برای شروع احتیاط های محافظتی مناسب نیازی به گزارش کشت تایید کننده عفونت نیست.

روش انجام:

• نمونه های کشت زخم اغلب بصورت سواپ در داخل لوله های استریل حاوی سرم فیزیولوژی به آزمایشگاه ارسال می گردد . سواپ آغشته به نمونه بیمار را کنار شعله، از لوله خارج نموده و روی محیط های مناسب کشت داده شود.
• در صورت درخواست اسمیر باید یک سواپ جداگانه به آزمایشگاه ارسال شود ، اگرنمونه ارسالی در داخل لوله بدون سواپ بود می توان از یک سواپ استریل برای برداشت نمونه استفاده کرد.
• انجام رنگ آمیزی گرم برای لام حاوی گستره نمونه، در مواقعی که پزشک می خواهد درمان آنتی بیوتیکی را قبل از آماده شدن نتیجه کشت شروع کند، بسیار مفید است. در چنین مواقعی پزشک براساس تجربه گذشته در مورد تشخیص احتمالی عامل بیماریزا، آنتی بیوتیک را آغاز می نماید.
• پس از کشت نمونه زخم روی محیط های مناسب و طی زمان انکوباسیون، آنتی بیوگرام به منظور شناسایی مناسب ترین درمان دارویی ضد میکروبی انجام می شود.
• بسیاری از عفونت های زخم حاوی بیش از یک نوع ارگانیسم هستند.
• اغلب ارگانیسم ها نیاز به زمانی حدود ۲۴ ساعت دارند تا در محیط کشت رشد کنند و گزارش مقدماتی پس از این مدت آماده می شود. گاهی ۴۸ تا ۷۲ ساعت زمان برای رشد و تشخیص ارگانیسم مورد نیاز می باشد.

وظایف بخش میکروب شناسی

• دارای برنامه‌ی كنترل كیفی براساس الزامات مرجع سلامت
• تحویل گرفتن نمونه ها از واحد نمونه گیری و نگهداری نمونه ها در شرایط مناسب حرارت طبق استانداردهای موجود در هر آزمایش
• بررسی نمونه ها از نظر مقدار و عوامل مداخله گر قبل از انجام آزمایش
• عودت نمونه های نامناسب جهت تکرار نمونه گیری و تکرار آزمایشات در صورت مشاهده موارد مشکوک
• انجام کنترل کیفی دستگاه ها، محیط های کشت، دیسک های آنتی بیوگرام ،معرف های مورد استفاده
• انجام کشت های میکروبی و خواندن و تفسیر آن ها بعد از ۲۴ تا ۴۸ ساعت
• خواندن کشت های خون و تفسیر آن ها بعد از ۲۴، ۴۸ساعت و ۳ هفته و یک ماه
• تشخیص و تعیین انواع باکتری ها در نمونه های میکروب شناسی از طریق استفاده از محیط های کشت افتراقی و آنتی سرم های مربوطه
• تهیه و نگهداری صحیح محیط های کشت روتین، اختصاصی و افتراقی جهت شناسایی باکتری ها
• سرعت و دقت لازم در انجام وظایف محوله و انجام صحیح مستندسازی های لازم
• تشخیص صحیح نمونه های کنترل کیفی خارجی

دستورالعمل نگهداري و استفاده از سويه هاي باكتريايی به روش بلند مدت و كوتاه مدت

هدف:

هدف از تهيه اين دستورالعمل تدوين روش های صحيح و مناسب ذخيره سازی و نگهداری باکتری ها به روش طولاني و کوتاه مدت، و چگونگي استفاده از آنها برای مقاصد مختلف مانند برنامه تضمين کيفيت (ارزيابي کيفي محيط های کشت، معرف ها، ديسک های آنتي بيوتيک و …) انجام آزمايش های تأييدی يا تکميلي (بررسي الگوی مقاومتي سويه ها با آزمايش تعيين حساسيت ضد ميکروبي، بررسي های اپيدميولوژی و …) در بخش ميکروب شناسي آزمايشگاه مي باشد. روش مناسب، روشي است که باکتری بتواند در آن شرايط زنده مانده، ضمن اين که ويژگي هايش حفظ شده و پايدار بماند.

نمونه:

 کشت تازه و خالص ميکروارگانيسم روی محيط جامد مناسب

 مواد، لوازم و تجهيزات:

• محیط محافظت کننده از سرما مانند ۵۰% fetal calf serum، ۱۰% ۰r 15% glycerol در Tryptic Soy Broth (TSB)i، یا Skim milk، یا خون دفیبرینه گوسفند
• محيط کشت آگار خوندار پليتي
• محيط کشت شکالت آگار پليتي
• محيط کشت آگار خوندار شيبدار لوله ای درپيچ دار
• محيط کشت شکالت آگار شيبدار لوله ای درپيچ دار
• محيط کشت Tryptic Soy Broth (TSB)i لوله ای درپيچ دار
• محيط کشت Cystine Tryptic Agar (CTA)i  لوله ای درپيچ دار
• محیط کشت Brain Heart Infusion Agar (BHIA)i شيبدار لوله ای درپيچ دار
• محیط کشت Cooked Meat لوله ای در پیچ دار
• روغن معدني يا پارافين مايع استريل
• ويال های شيشه ای يا پلاستيکي کوچک درپيچ دار استريل
• يخچال
• فریزر ۷۰- درجه سانتیگراد

روش انجام آزمايش:

نگهداري طولانی مدت (یک سال يا بيشتر):

 نگهداری طولاني مدت باکتری ها اين امکان را مي دهد که نمونه ميکروبي، ماه ها و حتي سال ها به صورت زنده باقي بماند. بهترين روش های نگهداری طولاني مدت شامل ليوفيليزاسيون (Freeze Drying)، نگهداری در فريزر i(Ultra Low Freezer) -70^◦c یا پایين تر و نگهداری در نيتروژن مايع ۱۹۶- درجه سانتیگراد  مي باشد.

روش های انتخابي و در دسترس:

۱- نگهداری در فريزر i(Ultra Low Freezer) -70^◦c

• باکتری مورد نظر را روی محيط مغذی مانند پليت آگار حاوی ۵ %خون گوسفند و در مورد ميکروارگانيسم های سخت رشد (پرنياز) روی محيط شکلات آگار کشت دهيد.
• پليت ها را به مدت ۲۴-۱۸ ساعت در دمای ۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد و در صورت نياز برای هر باکتری تحت شرايط CO₂ انکوبه نمایيد.
• بعد از انکوباسيون، خالص بودن و مرفولوژی کلني ها را بررسي نموده و در صورت نياز، تست های بيوشيميايي انجام دهيد.
• سپس از باکتری رشد يافته، سوسپانسيون غليظي در ۱۰۰-۵۰ میلی لیتر از يک محيط محافظت کننده از سرما (Cryoprotective) تهيه نماييد. اين محيط برای جلوگيری از تخريب سلول های باکتری در شرايط انجماد مورد استفاده قرار مي گيرد.

محيط های محافظت کننده از سرما عبارتند از:

• Skim milk
• خون دفيبرينه استريل گوسفند يا خرگوش
• Tryptic Soy Broth (TSB)i حاوی گلیسرول با غلظت نهایی ۱۵-۱۰ %
• ۵۰% fetal calf serum in broth

 

1. از سوسپانسيون باکتريايي فوق به مقدار ۱-۰/۵ میلی لیتر در ويال های شيشه ای يا پلاستيکي کوچک استريل توزيع کنيد. تعداد کافي ويال ذخيره را برای مصرف يک سال آماده نماييد.
2. بر روی ويال ها برچسب حاوی نام (يا کد) سويه و تاريخ تهيه سوسپانسيون را بچسبانيد. ويال ها را در فريزر ۷۰- تا۵۰- درجه سانتیگراد قرار داده و تا زمان مورد نياز در آن ذخيره نماييد. سويه ها را مي توان در برودت کمتر از ۵۰- درجه سانتیگراد به مدت طولاني نگهداری کرد.
3. در صورت عدم دسترسي به فريزر ۷۰- درجه سانتیگراد مي توان سويه ها را در فريزر ۲۰- درجه سانتیگراد نيز نگهداری نمود. در اين شرايط توجه به اين نکته ضروری است:
4. سويه های باکتريايي در اين برودت عمر کمتری (حداکثر يک سال) دارند و ممکن است تعداد زيادی از سلول ها از بين بروند. بنابراين توصيه مي شود برای اطمينان از زنده بودن سويه ها در فواصل چند ماهه، از کشت ذخيره فريز شده، کشت مجدد بر روی محيط مناسب تهيه شود.
5. در صورت نياز، يک ويال از کشت ذخيره فريز شده را بيرون آورده و محتويات آن را سريعاً زير آب جاری ولرم ذوب نمایيد.
6. سوسپانسيون را روی محيط آگار خوندار يا شکلاته (در مورد باکتری های سخت رشد) تلقيح نماييد، به گونه ای که کلني های ايزوله رشد کنند. پليت را به مدت ۲۴-۱۸ ساعت در دمای
    ۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد  و در صورت نياز در شرايط CO₂ انکوبه نماييد (ساب کالچر اوليه). قبل از استفاده برای آزمايش، از کشت ذخيره فريز شده، دو بار ساب کالچر انجام دهيد. ساب کالچر دوم همان کشت کاری  (Culture working) مي باشد.
7.  پليت ها را در دمای  ۸-۲ درجه سانتیگراد( در مورد ارگانيسم های غير سخت رشد)  يا شرايط مناسب برای هر نوع ميکروارگانيسم نگهداری نماييد.

توجه:

• ويال ذخيره مورد استفاده، بعد از ذوب شدن بايد دور انداخته شود و نبايد مجدداً فريز گردد.
• قبل از استفاده از سويه رشد يافته روی هر پليت بايد از خالص بودن سويه، اطمينان حاصل نمود.
• از کشت ذخيره فريز شده حداکثر تا ۳ پاساژ پشت سر هم ميتوان انجام داد. پس از آن، پليت بايد دور انداخته شود و از يک کشت ذخيره فريز شده ديگر استفاده گردد. پاساژهای پشت سر هم مکرر (بيش از ۳ پاساژ)، احتمال تغيير فنوتيپي سويه ها را افزايش مي دهد.

۲- نگهداري در دماي اتاق با كشت در محيط  BHIA

• محيط کشت Brain Heart Infusion Agar (BHIA)i را با شيب کم در لوله شيشه ای درپيچ دار تهيه نماييد. برای باکتری های سخت رشد، خون تازه يا خون حرارت داده شده، به محيط اضافه نماييد.
• روغن معدني) يا پارافين مايع( را در اون استريل نماييد.
• ميکروارگانيسم مورد نظر را روی سطح محيط کشت دهيد و در شرايط مناسب برای هر ميکروارگانيسم انکوبه نماييد.
• بعد از اطمينان از وجود رشد کافي، روغن استريل را به مقدار یک میلی لیتر روی سطح محيط بريزيد، به گونه ای که سطح شيبدار محيط را بپوشاند.
• لوله ها را با رعايت شرايط ايمني در دمای اتاق نگهداری کنيد.
• در صورت نياز به کشت مجدد سويه، با لوپ استريل از قسمت زيرين روغن برداشته و روی محيط آگار خوندار يا شکلاته کشت دهيد.
• از لوله ذخيره بعد از ۱۲-۶ ماه تجديد کشت نماييد.

۳- نگهداري در دماي اتاق با كشت در محيط TSA

اين روش فقط برای باکتری هايي که سخت رشد نيستند، مانند استافيلوکک و انتروباکترياسه به کار مي رود.

• محيط کشت آگار بدون کربوهيدرات را با عمق زياد در لوله شيشه ای درپيچ دار تهيه کنيد. محيط Tryptic Soy Agar (TSA)i پيشنهاد مي شود.
• باکتری را به صورت کشت عمقي در اين محيط تلقيح کنيد.
• محيط را به مدت ۲۴-۱۸ ساعت در دمای۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد انکوبه نماييد.
• سپس لوله درپيچ دار را در پارافين مذاب فرو ببريد، که کاملا در لوله را بپوشاند.
• لوله ها را با رعايت شرايط ايمني در دمای اتاق نگهداری کنيد. از لوله ذخيره بعد از ۱۲-۶ ماه تجديد کشت نماييد.

نگهداري کوتاه مدت (کمتر از یک سال):

۱- كشت در محيط CTA براي نيسريا و استرپتوكک

• محيط کشت Cystine Tryptic agar (CTA)i به اضافه  یک میلی لیتر سرم استريل اسب را با عمق زياد در لوله شيشه ای درپيچ دار تهيه کنيد .
• سويه نيسريا يا استرپتوکک را به طور عمقي در اين محيط کشت دهيد.
• محيط را به مدت ۷۲-۲۴ ساعت در دمای ۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد و CO₂ پنج درصد انکوبه نمایید.
• سپس لوله درپيچ دار را در پارافين مذاب فرو ببريد، که کاملا درِ لوله را بپوشاند.
• برای نيسرياها لوله را در ۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری کنيد و هر دو هفته يکبار تجديد کشت نماييد. برای استرپتوکک ها لوله را با رعايت شرايط ايمني در دمای اتاق نگهداری کرده و هر ماه تجديد کشت کنيد.

۲- كشت در محيط Cooked Meat براي باكتري هاي بی هوازي

• محيط Cooked Meat را در لوله های شيشه ای درپيچ دار تهيه کنيد.
• باکتری را در اين محيط تلقيح کنيد. محيط را به مدت ۷۲-۲۴ ساعت در دمای ۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد انکوبه نماييد.
• لوله ها را با رعايت شرايط ايمني در دمای اتاق نگهداری کنيد.
• هر دو ماه يکبار تجديد کشت نماييد.

۳- کشت در  i(Tryptic Soy Agar) TSAبراي باكتري هاي با رشد سريع

• باکتری مورد نظر را در سطح محيط TSA لوله ای درپيچ دار کشت دهيد.
• محيط را به مدت ۲۴-۱۸ ساعت در دمای ۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد انکوبه نماييد.
• پس از رشد کامل، لوله را در يخچال نگهداری کنيد.
• هر ۴-۲ هفته يکبار تجديد کشت نماييد.

۴- کشت در Sheep blood Agar (آگار خوندار) برای استرپتوکوک ها

• سويه مورد نظر را در سطح محيط آگار خوندار لوله ای درپيچ دار کشت دهيدد.
• محيط را به مدت ۷۲-۲۴ ساعت در دمای ۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد انکوبه نماييد.
• پس از رشد کامل، لوله را در يخچال نگهداری کنيد.
• هر دو هفته يکبار تجديد کشت نماييد.

۵- کشت در Chocolate Agar  (شکلات آگار) براي مننگوكک و هموفيلوس

• سويه مورد نظر را در سطح محيط شکلات آگار لوله ای يا پليتي کشت دهيد.
• لوله يا پليت را به مدت ۷۲-۲۴ ساعت در۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد انکوبه کنيد.
• لوله يا پليت را بعد از رشد در حرارت اتاق نگهداری کنيد.
• هر دو هفته يکبار تجديد کشت نماييد.

۶- کشت در Chocolate Agar برای گونوكک

• سويه مورد نظر را در سطح محيط شکلات آگار پليتي يا شيبدار لوله ای کشت دهيد.
• لوله يا پليت را به مدت ۷۲-۲۴ ساعت در ۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد انکوبه کنيد.
• پس از اين مدت، لوله يا پليت را مجدداً در اين درجه حرارت ( ۱ ± ۳۶ درجه سانتیگراد) نگهداری نماييد.
• هر دو روز يکبار تجديد کشت کنيد.

منابع برگزیده:

• آزمایشگاه مرجع سلامت، بخش میکروب شناسی
• تکنیک ها و تشخیص های آزمایشگاهی تالیف دکتر محمدرضا عابدی
• روش های آزمایشگاهی در باکتریولوژی تالیف دکتر احمدرضا بهره مند

• HENRY’S Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods 22 nd EDITION Richard A. McPherson, MD -2011
• Mosby’s Manual of Diagnostic and Laboratory Tests, 4th Edition By Kathleen Deska Pagana, PhD, RN and Timothy J. Pagana, MD, FACS
• Quality Control for Commerically Prepared Microbiological Culture Media- Approved Standard, Third Edition; M22–A3, Vol. 24 No. 19, June 2004.
• Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests- Approved Standard, Eleventh Edition; M02–A11, Vol. 32 No. 1, January 2012.
• Clinical Microbiology Procedures Handbook, second edition update, Garcia, Lynne S. & Isenberg, Henry D., 2007 .
• Basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology World Health Organization Geneva, 1991 .

 

 

عزيزاني که ساکن اهواز هستند ميتوانند از آزمايشگاه پاستور اهواز با بهترين امکانات و تکنولوژي روز، جهت هر نوع آزمايشي استفاده نمايند.

با تشکر مديريت سايت آزمايشگاه اهواز – پاستور